国产血竭龙血素A和龙血素B的含量测定及二者的相关性分析..docVIP

国产血竭中龙血素A和龙血素B的 含量测定及两者的相关性分析 宓鹤鸣 孙胜利 （第二军医大学药学院药物分析教研室，上海 200433） 姚庆芳 吴茵铭 罗四清 郑有顺 （广东名盛药业有限公司开发部， 广州 510240） 摘要：目的:RP-HPLC法测定不同品牌国产血竭中龙血素A和龙血素B的含量，并对龙血素A和龙血素B含量进行相关性分析。方法 :采用反相高效液相色谱法，乙腈-冰醋酸（1→90）（40：60）为流动相，流速：1.0ml/min;UV检测波长：270nm；柱温：室温。结果：龙血素A浓度4～24μg/ml范围内和峰面积呈线性相关，回归方程Y=855.8+8037.1X (r=0.9999)；龙血素B在20～120μg/ml范围内和峰面积呈线性相关，回归方程为Y=219.3+8081.8X (r=0.9999)。结论：所测6种国产血竭样品中龙血素B含量均未达到部颁标准的规定，龙血素A的含量明显高于龙血素B的含量，龙血素A和龙血素B的含量呈现明显的相关性。 关键词： 国产血竭 龙血素A 龙血素B 含量测定 HPLC法 相关分析 血竭是珍贵的中药传统品种之一，该药性平，味甘、咸，有活血祛瘀、消肿止痛、收敛止血之功效，主要用于跌打损伤、内伤瘀痛、外伤出血、溃疡不敛等症。以往血竭一直依赖进口。70年代以来，我国著名植物学家蔡希陶先生在云南孟连县发现剑叶龙血树资源可提取血竭，从此开始了国产血竭的研究。目前，广西研究的“龙血竭”已获得国家一类新药证书，并已收载于卫生部药品标准[1]。国产血竭已替代进口血竭在各地广泛使用。国产血竭的质量标准虽已转为正式标准，但经我们的实际应用，发现存在一定问题。龙血素A和龙血素B化学结构相似，按现行标准的方法、条件，两者色谱峰混杂，很难分离。本文重新探讨提取流程，优化分离条件，并对指标成分龙血素B和干扰成分龙血素A进行定量分析，从中探讨新的质量控制方法。 样品的来源 柬龙牌龙血竭及原材料：由广东名盛药业有限公司生产，批云杉牌国产血竭胶囊：云南个旧市制药厂，批大公牌龙血竭胶囊：中国广东省肇庆市制药厂，批号010202；雨林牌国产血竭胶囊：中国科学院西双版纳热带植物园制药厂，批号000306；芒果牌国产血竭原料药：广西中医学院制药厂。 实验及结果 2.1反相高效液相色谱法测定龙血素A的含量 2.1.1仪器和试剂 仪器：Waters 2487可变双波长紫外检测器，Waters 515型泵，CDMC-4色谱数据处理机 。 试剂：龙血素A对照品（本室自己分离得到，并经质谱和核磁共振鉴定结构，纯度99.9%），乙睛（色谱纯），其他所用试剂均为分析纯。 2.1.2对照品溶液的制备：精密称取龙血素A对照品4mg，加乙腈10 ml溶解，制成每1ml含400μg的溶液，作为标准贮备液。 2.1.3色谱条件 色谱柱：DiamonsilTM C18, 5μ，250mm×4.6mm，迪马公司；流动相：乙腈-冰醋酸（1→90）（40：60），流速：1.0ml/min；检测波长：270nm；灵敏度：1.00AUF；处理机衰减：2；柱温：室温。 系统适应性实验：在以上色谱条件下，注入供试品溶液，塔板数按龙血素A峰计算大于10000，龙血素A与龙血素B峰的分离度大于1.2。 2.1.4标准曲线和线性范围 精密量取标准贮备液溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，定量稀释于10ml容量瓶中，摇匀，各取20μl，注入液相色谱仪。色谱图见图1。 以龙血素A的峰面积为因变量（Y），龙血素A对照品浓度为自变量（X），求得回归方程为：Y=855.8+8037.1X（r=0.9999）； 峰面积与浓度在4～24μg/ml范围内呈良好线性关系。 2.1.5方法考察 （1）日内精密度和日间精密度，精密量取龙血素A对照品溶液0.5ml，稀释于10ml容量瓶中，摇匀，一日内进样5次，测定，得日内精密度RSD为0.64 %，连续进样3天得日间精密度RSD为1.49 %。 （2）加样回收率试验：在已知含量的样品中精密加入一定量的龙血素A，按样品测定的供试品溶液的制备和测定方法试验，计算得回收率为102.7 %（n=3）。 2.1.6样品测定 精密称取样品粉末约1g，加硅藻土2g混匀，置索氏提取器中，加石油醚（60～90℃）100ml，水浴加热回流2hr，弃去石油醚部分，再加氯仿100ml，水浴加热回流6小时，得提取液，浓缩至干，加醋酸乙酯适量溶解，移至100ml量瓶中，用醋酸乙酯洗涤容器3次，洗液并入量瓶中并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，收集续滤液作为供试品溶液。精密量取供试液1ml，挥干乙酸乙酯，用乙腈定容于10ml