探讨白藜芦醇对动脉粥样硬化兔心肌组织凋亡的影响.docVIP

探讨白藜芦醇对动脉粥样硬化兔心肌组织凋亡的影响　　摘要：目的 探讨白藜芦醇(Res)对动脉粥样硬化兔心肌组织线粒体途径凋亡的影响。 方法 健康雄性新西兰白兔70只，随机分为5组：正常组、病理对照组、病理+低剂量Res组(4 mg·kg-1·d-1)，病理+中剂量Res组(8 mg·kg-1·d-1)、病理+高剂量Res组(16 mg·kg-1·d-1)。分笼饲养12周后，取左心室尖部心肌组织。H-E染色观察心肌组织形态学改变，原位末端标记法检测心尖部细胞凋亡率，半定量RT-PCR检测bax、bcl-2的mRNA变化。 结果 H-E染色下各组细胞形态学改变不明显;病理对照组细胞凋亡指数高于正常组(P　　关键词： 藜芦生物碱类; 动脉硬化; 基因，调节; 心血管药物(中药); 细胞凋亡; 心肌 　　许多细胞及动物实验研究表明，白藜芦醇(Resveratrol,Res)具有抗癌、抗血栓、抗过敏、抗氧化等药理作用[1]，是红葡萄酒中具有心血管保护作用的最重要的物质。笔者前期工作探讨了Res对血管内皮细胞的保护作用，以及改善动脉粥样硬化兔心肌纤维化的作用[2-3]。本研究将进一步探讨Res对动脉粥样硬化兔模型心肌细胞凋亡的影响，以及心肌细胞抗凋亡基因bcl-2、促凋亡基因bax表达情况。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 主要试剂 Res(上海纳贝生物科技股份有限公司，批号：RESXX0401);吐温80(福建省医学科学研究所);TRIZOL试剂(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(美国Promega公司);Tap酶及dNTP(日本Takara公司);原位细胞凋亡检测试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。 　　1.1.2 主要仪器 石蜡切片机(RM2245型，美国Shandon公司);生物组织摊烤片机(JK-5型，武汉俊杰电子有限公司);组织匀浆机(T18 ULTRA-TURRA型，德国Polytron公司);核酸蛋白分析仪(DU640型，美国Beckman公司);PCR扩增仪(Mastercycler Personal型，德国Eppendorf公司);全自动凝胶成像分析系统(Imagemaster VDS-CL型，瑞典Amersher Pharmacia公司)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 动物分组及处理 普通级8周龄健康雄性新西兰白兔70只(上海生旺实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK沪2002-0011)，饲养于福建省医学科学研究所动物实验室(许可证号：SYXK闽XX-0002)，体质量(2.0±0.2) kg。经普通饲料(苜蓿草粉)适应性喂养10 d后，随机分成5组，开始实验(实验第0周)：(1)正常组10只，喂普通饲料+生理盐水10 mL灌胃。(2)病理对照组18只，喂高脂饲料+0.5%吐温溶液10 mL灌胃。(3)病理+低剂量Res组14只，喂高脂饲料+Res 4 mg·kg-1·d-1稀释于0.5%吐温溶液10 mL灌胃。(4)病理+中剂量Res组14只，喂高脂饲料+Res 8 mg·kg-1·d-1稀释于0.5%吐温溶液10 mL灌胃。(5)病理+高剂量Res组14只，喂高脂饲料+Res 16 mg·kg-1·d-1稀释于0.5%吐温溶液10 mL灌胃。高脂饲料配方[4]：1%胆固醇+5%蛋黄粉+5%猪油+0.5%胆盐+88.5%普通饲料。每只兔限饲料100 g/d，自由饮水，实验第0周开始灌胃，每日1次，连续给药12周。上述Res剂量参照文献[5]。 1.2.2 组织切片观察 实验动物于第12周末称质量后予戊巴比妥钠麻醉，立即剖开胸腔，取兔心尖部心肌组织标本置于10%中性福尔马林溶液固定24 h，常规石蜡包埋、梯度脱水、透明、浸蜡、包埋，5 μm厚连续切片。 　　1.2.3 苏木素伊红(H-E)染色 二甲苯脱蜡蒸馏水冲洗3次，每次3 min，在苏木素溶液中浸泡10 min，用蒸馏水冲洗3次，每次3 min，取出后在1%盐酸酒精中分化，立即置入蒸馏水中冲洗;在伊红溶液中浸泡5 min，取出后用蒸馏水冲洗干净，经梯度酒精脱水、二甲苯透明1～2 min，共3次。中性树脂封片后显微镜观察。福建医科大学学报 2016年11月 第43卷第6期朱鹏立等：Res对动脉粥样硬化兔心肌组织凋亡的影响 　　1.2.4 原位末端标记检测心肌细胞凋亡 采用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的生物素平移末端标记技术(TUNEL法)标记凋亡心肌细胞，按试剂盒说明书操作。切片常规脱蜡脱水，微波抗原修复，新鲜配制3%H2O2，室温处理10 min，PBS冲洗3 min×2次，20 μg/mL蛋白酶K消化，PBS冲洗3 min×2次，滴加TUNEL混合液，于孵育盒中37 ℃ 60 min，PBS冲洗3 min×3次