有关体外培养人牙周膜细胞方法的探讨.docVIP

有关体外培养人牙周膜细胞方法的探讨摘要：目的： 研究如何提高体外培养人牙周膜细胞（hPDL）的成功率，为简便、快速地获得大量成活率高的hPDL膜细胞，建立体外细胞模型提供一定的实验方法。方法： 利用3种不同方法（组织块法、酶消化组织块法、全牙消化法）进行牙周膜细胞的原代培养，用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源；通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果： 3种方法获得的细胞形态和生物学行为大致相同；波丝蛋白抗体染色阳性，角蛋白抗体染色阴性。组织块法培养的细胞同源性好，但初代培养时间长；全牙消化法的原代培养成功率高于其他2种方法。结论： 通过对牙周膜细胞培养方法的改良，可以显著提高hPDL原代培养的成功率。 关键词： 牙周膜； 细胞培养； 免疫组织化学 细胞体外分离培养是研究复杂的生物系统的重要手段，细胞培养条件下，将细胞从复杂的体内环境转移到较为简单的体外环境，可对细胞学研究中的变量进行分离和控制。上世纪70年代以来，国外学者对牙周膜细胞（Periodontal LigamentCells PDL）分离纯化进行了大量的探索和研究，且成功地从猴、猪、人等牙周膜分离培养出牙周膜细胞［1～3］。人牙周膜细胞（hPDL）分离培养主要有酶消化法和组织贴块法［4］。国内外学者对这2种方法评价不一，并且在这2种方法的基础上进行改进提出了酶消化组织块法和全牙消化法［5］。对组织块法、酶消化组织块法和全牙消化法这3种方法做了一些比较，以寻求hPDL体外培养的最佳方法。 　　1 材料和方法 　　1.1 试剂及主要实验仪器设备 　　α-MEM 培养液（Hyclone，USA），胶原酶（Type I，Sigma，USA），胎牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（配成0.25 %,过滤分装，冷冻保存），青霉素 100 U/ml，链霉素 100 mg/L；SABC 免疫组织化学试剂盒（武汉博士德），角蛋白抗体及波丝蛋白抗体（武汉博士德），二氧化碳恒温培养箱，倒置相差显微镜，血球计数板。 　　1.2 方法 　　1.2.1 组织块法培养hPDL 　　（1）取材：选择健康青少年（12～18 岁）正畸拔除的健康的双尖牙，超净工作台内用刀片仔细刮除附着牙龈及根尖组织，用 D-Hanks液冲洗 3 次；（2）无菌处理：将牙冠浸入 5.25%次氯酸钠溶液中 2 min，再用含高浓度双抗的D-Haks液冲洗2遍。按照司徒镇强［6］传统组织块培养法进行原代培养；（3）传代：细胞汇合至培养瓶 80%时，用0.25%的胰蛋白酶消化液1∶2消化传代。 　　1.2.2 酶消化组织块法培养hPDL 　　酶消化组织块法原代培养在取材、无菌处理上与组织块法相同。刮下根中 2/3 的牙周膜后，不剪，移入离心管内。0.1%胶原酶37 ℃消化30 min，其中，每5 min振荡1次，当肉眼观察到培养液略混浊，显微镜下见组织块松散时，离心，弃上清液，用含血清及双抗的培养基漂洗1次后弃上清液，收集组织块，将组织块平铺于培养瓶底，翻转培养瓶，向内加入 4 ml 培养液，置CO2培养箱孵育2 h，使组织块贴壁，再翻转培养瓶培养；传代与组织块法相同。 1.2.3 全牙消化法培养hPDL 　　全牙消化法原代培养牙周膜细胞取材、无菌处理与组织块法相同。将牙齿放入装有0.1%胶原酶的青霉素小瓶内，牙根向下，使消化液浸没牙根，37 ℃温箱内消化1 h，用吸管充分吹打牙根表面，加入等量含血清的培养基，离心，弃上清液，加入3 ml培养基（含10%胎牛血清、青霉素 100 U/ml、链霉素 100 mg/L）吹打形成细胞悬液，移入25 ml培养瓶内，置CO2培养箱内进行培养，3 d换液1次，待细胞铺至瓶底80%时用0.25%胰蛋白酶1∶2消化传代。 　　1.3 细胞的生长情况观察 　　1.3.1 倒置相差显微镜连续观察细胞原代和传代生长情况。 　　 　　1.3.2 HE染色 　　取生长状态良好的第5代细胞进行爬片，用苏木精-伊红染色，观察细胞形态。 　　1.3.3 细胞免疫化学染色 　　将培养的第3代hPDL接种于置有盖玻片的培养瓶中，按常规 SABC 法操作，进行波丝蛋白抗体、角蛋白抗体染色，光镜下观察染色情况。 　　1.3.4 描绘细胞生长曲线 　　取3块 24 孔板，分别取3种方法培养的第5代细胞，调整细胞浓度为1×104个/ml接种于 24 孔板，每孔100 μl，CO2培养箱内培养4 h后每孔加0.5 ml培养液继续培养，每天每组各取 3孔的细胞作细胞计数，连续观察8 d，绘制细胞生长曲线。 　　2 结果 　　2.1 形态学观察3种方法培养的hPDL形态学上无太大区别，均呈长梭形或星形，胞突细长，胞体丰满，胞浆均匀，中央有圆形或椭圆型的胞核，细胞呈放射状、漩涡状排列（见图1～3