市售国内紫锥菊提取物质量评价..docxVIP

专业方法测定市售紫锥菊提取多酚含量试验紫锥菊在欧美各国被广泛用于免疫促进和调节剂，其预防和治疗各种感染性疾病的疗效得到越来越多临床医生的肯定。目前，紫锥菊植物在我国已成功引种并形成了一定的规模，紫锥菊提取物的市场应用于需求发展迅速，主要规格是4%紫锥菊多酚。本次实验中，源森生物对国内市售6批紫锥菊提取物进行检测对比，以期为客观评价国内紫锥菊提取物的质量提供依据。一、市售紫锥菊提取物质量评价实验所需材料安捷伦高效液相色谱仪；安捷伦液质联用仪；UV2401 PC紫外-可见分光光度计；250W电脑型超声清洗机；AE240电子分析天平。绿原酸，没食子酸对照品；乙腈，甲醇为色谱纯，水为超纯水，无水乙醇、无水碳酸钠为分析纯，福林酚试剂为实验试剂。6批紫锥菊提取物市售产品(ZZJ-1~ZZJ-6) 购自包括源森生物国内6家生产商。二、市售紫锥菊提取物质量评价实验方法与结果 （一）对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的绿原酸对照品10.05mg，置50mL量瓶中，加入70%甲醇溶液少许，超声溶解，70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，得对照品贮备液，再精密移取5mL储备液，置 50mL量瓶中，70%甲醇溶液定容至刻度，即得对照品溶液（0.0201g.L-1）。（二）供试品溶液的制备平行取各批次紫锥菊提取物约1.2g，精密称定，分别置圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇25mL，精密称定质量，热回流提取15min，冷却至室温，称量并以70%甲醇补足质量，摇匀，静置，取上清液，离心，取续滤液备用。（三）相关峰的指认及美国药典HPLC方法的优化1. 相关峰的指认 利用LC-MS同时参考文献［侯团章，中草药提取物.第1卷［M］.北京: 中国医药科技出版社，2004: 9.］中的相对保留时间，对各成分定性。色谱条件为Agilent ODS色谱柱(4.6mmx150mm,5μm)；液相方法为美国药典方法，但需要指出的是，需将流动相中不易挥发的磷酸替换为易挥发的甲酸。分别取6批供试品溶液2μL注入色谱仪，记录色谱图，见图1~3。液质TLC图未见紫锥菊苷，其中2个主峰分别为咖啡酸和菊苣酸。2. 美国药典方法的色谱条件与系统适用性试验 由图1可见，甲酸水-乙腈系统作为流动相峰形不好，故参考应用美国药典的色谱条件，Kro-masilODS色谱柱(4.6mmx150mm,5μm)。分别取绿原酸对照品溶液和供试品溶液各5μL注入色谱仪，按上述色谱条件，记录色谱图，见图4。其中绿原酸峰较小且与相邻峰分离度小于1.5，说明该方法需进一步优化。3. 色谱条件优化与系统适用性试验 Kromasil色谱柱 (4.6mmx150mm,5μm) ;流动相0.1%磷酸溶液 ( A)-乙腈 ( B ) ，梯度洗脱:0min，10%B;30min,35%B;40min,90%B，后运行5min。流速1.0mL.min-1；检测波长330nm；柱温35℃。分别取绿原酸对照品溶液和供试品溶液各5μL注入色谱仪，按上述色谱条件，记录色谱图，见图5。理论塔板数以绿原酸峰计算应不低于1万，与相邻峰之间分离度大于1.5，说明优化后的方法适用于紫锥菊提取物的分析检测。（四）线性关系考察分别精密吸取对照品贮备液0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0mL，置于10mL量瓶中，用70%甲醇溶液稀释至刻度得质量浓度为1.005,2.01,4.02,8.04,12.06,16.08mg.L-1的对照品溶液。吸取上述不同质量浓度的对照品溶液各5μL，分别进样测定，以峰面积(Y) 对对照品进样量( μg) 进行回归，得回归方程Y=2711.8X-0.5264(r=0.999 9)，结果表明绿原酸在0.005 025~0.0804μg与峰面积线性关系良好。（五）精密度试验取绿原酸质量浓度为12.06mg.L-1对照品溶液各5μL，连续测定5次，记录峰面积并计算，RSD0.28%，表明仪器精密度良好。（六）稳定性试验 取ZZJ-1供试品溶液在0.2,4,8,12h分别进样5μL，记录峰面积，RSD1.1%，表明供试品溶液在12h内稳定。（七）重复试验取ZZJ-1样品6份，按供试品溶液制备方法提取、测定，结果绿原酸平均质量分数为0.0101%，RSD0.57%，表明该方法重复性良好。（八）加样回收率试验精密称取已知含量样品(ZZJ-1) 约1.2g，共9份，精密加入绿原酸质量浓度为mg.L-1的对照品储备液0.5，0.5，0.5，0.6，0.6，0.6，0.7，0.7，0.7mL，按2.2项下方法制备供试液，在上述色谱条件下进样5μL进行分析，绿原酸平均回收率为99.68%，RSD0.79%。（九）定量法参照美国药典方法，分别计算咖啡酸、菊苣酸、绿原酸、紫锥菊苷( 未检出) 在提取物中的含量，计算公式为: 2 500F（C