水生生物分子生物学..docVIP

第二章 核酸的结构 DNA的结构 1.一级结构：DNA分子中核苷酸通过3’，5’-磷酸二酯键连接的排列顺序。 2.二级结构（双螺旋）：两条单链DNA通过碱基互补配对的原则形成的双螺旋结构。 影响双螺旋结构稳定性的因素：氢键；磷酸酯键；碱基堆积力 (非特异性结合力)；碱基内能；磷酸基团间的静电斥力? 3.A,B和Z型DNA的结构： B-DNA，右手双螺旋，细胞内最稳定、最常见的构象； A-DNA，右手双螺旋，存在于脱水DNA，DNA-RNA杂交分子，双链RNA； Z-DNA，左手双螺旋，与基因的表达调控有关 4.反向重复序列 反向重复（回文序列）：指在双链DNA中某些区段含有两个结构相同、但方向相反的序列。 较长的回文结构，可形成茎环结构(发夹结构)或十字形结构； 较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性内切酶的识别位点。 三股螺旋DNA 由一条寡核苷酸链通过与双链DNA形成Hoogsteen键，在其大沟处紧密缠绕而成。 无论何种形式的三螺旋 DNA, 中间链必须是 Purin链 PU + PU/PY (偏碱性介质中稳定) ；PY + PU/PY (偏酸性介质中稳定) 常见类型 （二） DNA的变性、复性 DNA变性（DNA Denatu ration）：双螺旋DNA溶解成单链的现象，也称溶解。 DNA复性（DNA Renaturation）：变性DNA在一定条件下重新恢复双链的过程，也称退火（Anneal）。 变性过程的表现 ：S.S.DNA粘度降低；S.S.DNA 沉降速度加快；S.S.DNA分子的A260nm UV 值上升 1.增色效应与减色效应 增色效应：在DNA的变性过程中，紫外吸收(260 nm)值增大。DNA变性后增加25－40% 减色效应：在DNA的复性过程中，紫外吸收(260 nm)值减小。而RNA变性后，约增加1.1% 2.Tm (melting temperature) ：使DNA双螺旋结构解开一半的链时的温度。 影响 Tm值的因素 即影响DNA变性生物因素： 在 A, T, C, G 随机分布的情况下：GC%愈高，Tm值愈大；GC%愈低，Tm 值愈小 GC%含量相同的情况下：AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小 片段的长度： 变性剂（如尿素，酰胺等）： 介质中的离子强度：离子强度高，Tm高 极端pH条件的影响：一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素均将使Tm 值降低 3.DNA 分子的复性 (anneal or renaturation) 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 影响DNA复性过程的因素 ： 阳离子浓度：0.18 ~ 0.2M Na+ 可消除polydNt 间的静电斥力 温度：复性反应的温度 Tm - 25℃ S.S. DNA分子长度：S.S. DNA愈长/短，分子扩散愈慢/快，复性愈慢/快 S.S, DNA 的初始浓度： DNA 分子中, dNt 的排列状况 (随机排列, 重复排列) 4.核酸的杂交 亲缘关系相近的不同来源DNA单链或DNA单链与RNA单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过程称为分子杂交 常用的核酸分子杂交： Southern 杂交（DNA + DNA）:Southern 于1975年建立，将DNA固定在滤膜上，用标记好的同位素DNA探针与之杂交，通过放射自显影显示与探针互补的区带，识别特异序列。 Northern 杂交(RNA + DNA):研究对象是mRNA，探针一般是DNA。将RNA固定在滤膜上 ，用DNA探针与之杂交。 Western杂交(蛋白质 ＋ 蛋白质): 抗原与抗体的杂交,研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术 原位杂交（in situ bloting）:利用标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的DNA或RNA序列的核酸杂交技术 RNA的结构 mRNA：messenger RNA 占细胞总RNA的5%左右，含量最少，代谢活跃。mRNA在蛋白质的生物合成中起模板作用。 tRNA：transfer RNA 占细胞总RNA的15%左右。是结构研究最清楚的一类RNA。在蛋白质的生物合成中，tRNA起携带氨基酸的作用。 rRNA：ribosomal RNA 占细胞中总RNA80%左右。大肠杆菌rRNA中有三种: 16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA；真核细胞rRNA中有四种，28SrRNA、18SrRNA、5.8SrRNA、5SrRNA。核糖体是蛋白质合成的场所 小分子RNA 核不均一RNA（hnRNA）、核内小RNA（snRNA）、核仁小RNA、反义RNA（asRNA）, 胞质小RNA(sc RNA) 原核生物mRNA结构特点： 1