新·20120321_细胞培养.pptVIP

哺乳动物细胞冷冻保存 冷冻保存要点 冷冻过程要缓慢。4℃ 30－60 分钟→-20℃ 30 分钟 →-80℃ 16－18 小时（或过夜）→液氮长期保存 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。 常用细胞冷冻保存液 10％DMSO ＋ 完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液） 10％甘油＋ 完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液） 冷冻保存细胞的解冻与复苏要点 快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟） 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中 解冻冷冻保存细胞的离心方法 从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴中快速解冻 将1－2ml 冻存细胞液加入到25ml 新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀 用80g 离心2－3 分钟，弃上清液 用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞 接种细胞到培养瓶中，起始密度为3×105/ml。 细胞的原代和传代培养 原代细胞培养原理 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例） 取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污 切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清 消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养 原代细胞培养结果 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长 如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层 传代细胞培养原理 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次 传代细胞培养操作 将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟 在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液 将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养 传代细胞培养结果 一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代 细胞计数及活力测定 实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作：? 1.盖好盖玻片：取血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。? 2.制备计数用的细胞悬液：0.5ml细胞悬液到一离心管中，加入0.5ml台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，分别数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中死细胞和活细胞数。 5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：  （细胞悬液的细