重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达鉴定.docVIP

重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达、鉴定 【摘要】 目的：利用PCR技术[1]扩增hIL-8?cDNA，将其与酶切后的原核表达载体pKpL3a（含PL启动子）质粒连接，并在大肠杆菌中进行表达、鉴定。方法：PCR技术扩增hIL-8?cDNA获取目的基因，大肠杆菌质粒提取，将目的基因连接到大肠杆菌表达载体pKpL3a质粒中，重组DNA分子转化到Pop2136大肠杆菌中，利用其所产生的温度敏感性λ阻遏蛋白来调控外源基因表达，经ELISA反应检测其表达水平。结果：带hIL-8基因的重组pKpL3a质粒成功转化到Pop2136大肠杆菌中，经诱导，表达了IL-8并经ELISA反应检测了其表达水平。结论：hIL-8成功在大肠杆菌中表达。? 【关键词】hIL-8，?PCR?，重组DNA 【Summary】 Purpose：Connecting the hIL-8 cDNA which is amplificated using PCR technology with the plasmid of prokaryotic expression vector digested pKpL3a (including PL promoter),and detecting the expression and identification of recombinant hIL-8 in E.coli。Method：Get target gene by amplificating hIL-8?cDNA using PCR technology. Extract the E.coli plasmid. Connect the target gene with E.coli plasmid pKpL3a expression vector. Transform recombination DNA into E.coli Pop2136, and regulate gene expression of exogenous using the temperature-sensitive λ repressor protein, then detect the expression levels by ELISA reaction。Result：Recombinant plasmid PKpL3a with hIL-8 gene is successfully transformed into E.coli Pop2136 and expresses IL-8.The expression level of the IL-8 is detected by ELISA reaction.Conclusion：hIL-8 is successfully expressed in E. coli.? 【Keywords】hIL-8，?PCR?，Recombination DNA 白细胞介素8（Interleukin-8）是一种具有趋化作用的细胞因子，对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞具有区划作用，并可促进中性粒细胞的活化，在炎症反应中是一种重要的炎症因子。另外，IL-8还具有促进造血细胞增殖及新生血管生成作用，在伤口愈合和肿瘤生长及转移的过程中发挥重要作用。 天然来源的IL-8含量极低，难以大批量制备，因而只能利用基因工程技术进行表达和生产[2]。本实验通过PCR获得IL-8的c-DNA，将其连接于原核表达载体pKpL3a（含PL启动子）中，用温度诱导表达技术使外源基因得以表达。 1 材料与方法 1.1 材料试剂 ⑴ 模板（cDNA文库，CLONTECH公司）；大肠杆菌（含pKpL-3a质粒）； ⑵ 上游hIL-8 5ˊ引物（agt?gct?aaa?gaa?ctt?aga?tgt Tm=56℃，由Takara公司合成）； 下游hIL-8 3ˊ引物（ccg?tct?aga?tta?tga?att?ata?agc?cct?ct Tm=56℃，由Takara公司合成）； ⑶ 酚-氯仿-异戊醇；NaAc；70％乙醇，无水乙醇； ⑷ 缓冲液A（50mM葡萄糖，10mM EDTA，25 mM Tris-HCl，pH8.0）；碱溶液；乙酸缓冲液；TE缓冲液；RNA酶A溶液； ⑸ TAE电泳缓冲液；GEBS样本液；溴化乙锭； ⑹ LA培养基；LA培养皿；100mM CaCl2； ⑺ 包被抗体（抗IL-8单克隆抗体）；酶标抗体（酶标记IL-8单克隆抗体）；标准品（rHuIL-8，200ng/ml）；包被缓冲液（Ph9.6 0.05M CBS）；抗体稀释液（pH