EHS-M-W-002.0生活饮用水中大肠菌群检测细则(多管发酵法) W.docVIP

适用范围及标准 适用于生活饮用水、水源水、游泳池水中大肠菌群的测定。 技术标准 GB/T 5749-2006 《生活饮用水卫生标准》 GB/T 5750.12-2006 《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》 DB 31/890-2015《公共游泳场所卫生管理规范》 检测原理 2.1 总大肠菌群指一群在37 ℃、24 h培养能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.2 耐热大肠菌群指一群在44.5 ℃仍能生长且发酵乳糖产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.3大肠埃希氏菌是指一群能生长发酵乳糖产酸、产气且在含有荧光底物的培养基上44.5 ℃培养24 h产生β-葡萄糖醛酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 仪器和设备 3.1 高压蒸汽灭菌器 3.2 冰箱：2 ℃—8 ℃ 3.3 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 3.4 天平 PH试纸 恒温水槽：44.5 ℃ 生物安全柜 紫外光灯：6W、波长366nm 平皿：直径为9cm 试管 刻度吸管 小倒管 3.13 金属接种环 培养基和试剂 乳糖蛋白胨培养基：称取乳糖蛋白胨于蒸馏水中加热溶解，充分混匀，分装到带有倒管的试管中(每管10 mL)， 115 ℃高压灭菌20min。（注：双料乳糖蛋白胨即蒸馏水不变，乳糖蛋白胨的成分量加双份。） 伊红美兰琼脂平板：称取伊红美兰琼脂，加热溶解，倾注灭菌平皿，每皿约15ml。冷凝后，倒置4℃冰箱保存，待用。 革兰氏染色液（染色方法见试剂使用说明书） EC培养基：称取EC培养基干粉，加热溶解，调PH为6.9±0.2，分装到带有倒管的试管中(每管10ml)，121 ℃高压灭菌20 min，备用。 10 %（m/m）硫代硫酸钠溶液：121 ℃高压灭菌20 min。 4.6 乳糖胆盐发酵培养管：称取乳糖胆盐，加热溶解，调PH至7.4，分装到带有倒管的试管中(每管5 mL),115 ℃高压灭菌15 min。（注：双料乳糖胆盐发酵管即蒸馏水不变，乳糖胆盐加双份。） 4.7 EC-MUG管：称取本培养基干粉，加热溶解，在366nm紫外光下检查无自发荧光后分装于试管中，115 ℃高压灭菌20 min，最终PH为6.9±0.2。 操作步骤 总大肠菌群 5.1.1 5管法：无菌吸取10 ml水样加入双料乳糖蛋白胨培养液中，取1 ml水样加入单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1 ml水样加入9 ml生理盐水中混匀作10倍稀释后取1 ml(即0.1 ml水样)加入单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接接种五管双料培养基，每管接种10 ml水样。 5.1.2 15管法：检验水源水时，如污染严重的水样，应加大稀释倍数，可接种1，0.1，0.01 ml甚至0.1，0.01，0.001 ml，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1 ml以下水样时，必须作10倍稀释后取1 ml接种。 5.1.3 轻摇试管，使液体充分混匀，置36 ℃±1 ℃培养箱中培养24 h。 5.1.4 观察每管是否产酸、产气，如不产酸也不产气则报告为大肠菌群阴性；若液体变黄且有气体产生则为试验阳性，需做进一步的证实试验。 5.1.5 平板分离：自试验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美兰琼脂平板上，置36 ℃±1 ℃培养箱中培养18～24 h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。 5.1.6 复发酵试验：挑取可疑大肠菌群菌落进行革兰氏染色，同时接种单料乳糖发酵管，置36 ℃±1 ℃培养箱中培养24 h。 5.1.7 结果报告：凡乳糖发酵管产酸、产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，为大肠菌群阳性。记下实验的阳性管数，查表得出100 ml水样中总大肠菌群的MPN值。15管法结果见附表1，5管法结果见附表2，稀释样品查表后所得结果应乘以稀释倍数。若所有乳糖发酵管阴性，则报告总大肠菌群未检出。 5.2 耐热大肠菌群 5.2.1从测总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管（产酸产气）中无菌取1~2接种环菌液转种于EC培养基中，轻摇试管，使液体充分混匀，置恒温水浴箱中（水浴箱的水面应高于试管中培养基的液面）44.5 ℃培养24±2 h。 5.2.2若只检测耐热大肠菌群时，可用直接多管耐热大肠菌群方法，即在第一步乳糖发酵试验时按《水中总大肠菌群检测细则（多管发酵法）》5.2.1或5.2..2接种乳糖蛋白胨培养液，置恒温水浴箱中44.5 ℃±0.5℃培养18~24 h后，以下步骤同5.2.1。 5.2.3观察每管是否产酸产气，如不产酸产气则报告为