水稻群體分离中cry1Ab基因的遗传分析.docVIP

水稻分离群体中cry1Ab基因的遗传分析 摘要: 含有cry1Ab基因的三种转Bt基因系（Tarom Molaii，Neda和Nemat）与常规稻品种杂交（crossed）。通过实地考察研究以及F2和BC1群体后代的PCR分析，对三种基因系二化螟抗性的状况进行调查。二化螟侵染的表型和分子水平上的cry1Ab和 RG100 引物聚合酶链反应分析得知，F2 和 BC1的分离群体的单基因分离率分别是3: 1 和 1: 1。在田间和实验室条件下， 1346和 243 个单独植物的表型及基因型分析获取的这些结果表示，cry1Ab 基因在籼型/籼稻遗传背景的后代中稳定遗传。因此，快速发展足够的抗虫性和理想农艺性状的转Bt基因水稻品种，可通过常规育种与分子标记辅助选择相结合来实现。 引言 水稻是最重要的粮食作物，世界人口的40%以其为主食。 90%以上的稻米的生产和消耗是在亚洲 (胡什和 Brar，2002年)。 2000 年全球人口超过6 亿，因此到2025年，一定要生产多于现在50%的粮食以满足日益增加的人口的需求。水稻生产效率受到几种非生物和生物应力的严重影响，包括害虫造成的损害。螟虫是在亚洲水稻生长环境中的慢性害虫。它们比任何其他组的水稻害虫会导致更多的产量损失(Savary et al.，2000年)，稻田中50%杀虫剂是针对鳞翅类(Ghareyazie et al., 1997; Shu et al., 2000; Tu etal., 2000; Ye et al., 2003; Ramesh et al., 2004; Bashir etal., 2005). 这种转 bt 基因水稻植株意味着对害虫综合的管理 （IPM） 程序作出了重要贡献的一种有前途的机会(Mohan et al., 2003)。转基因作物的稳定遗传和转基因的表达对传统育种方案中基因工程的成功应用具有重要作用(Wu et al., 2002)。含有土壤细菌苏云金芽孢杆菌 (Bt)基因的水稻的转化是常用方法。这种方法为植物育种家利用其他物种基因提高对昆虫的抗性提供一个机会。一旦一个基因稳定导入水稻植株，它可以通过经典育种的程序被利用于新品种的发展，特别是在现代的技术并不总是可用的发展中国家(Wang et al., 2002).。 外源基因的遗传和稳定表达已在不同转基因植株中被广泛研究，其中包括水稻。Gahakwa et al. (2000) 研究了不同遗传背景下，多种标记和杀虫转基因的遗传和表达。他们对孟德尔方式中三代的所有转基因传递的真实反映，表明了cry1Ab基因在转基因株系中以单显性位点整合– 18系和DN - 32 – 6与转基因的Neda之间的杂交也同时进行。授粉的穗使用正确袋装。由此产生的F1代种子用同样的方式种植在明年（2007）获得F2代种子。DN-33-18/Neda-Bt以及DN-32-6/Neda-Bt杂交的F1代与各自轮回亲本回交获得BC1代后代。采用传统田间管理方式，但是在整个实验过程中没有农药应用。氮磷钾化肥使用量分别是250、 100、 50Kg /ha。 实地抗性评估 在营养与籽粒灌浆阶段，对F2 和 BC1 后代个体抗性进行评价，以植物坏心和白头作为对二化螟敏感性的症状进行识别(Ghareyazie et al., 1997).。对整个种群中每个植株由SSB引起的坏心和白头现象做好记录。为了确定SSB引起的坏心和白头的症状，解剖坏心和白头的茎的分蘖处观察由于SSB伤害导致的幼虫或者害虫经过的痕迹(Shu et al.,2000).。 PCR分析 水稻叶片中DNA按照Dellaporta et al. (1983).描述的方法提取。PCR分析以cry1Ab 和 RG100 引物按照Ghareyazie et al. (1997完成。PCR反应用25μl 混合物体系进行检测，包含50 ng模板DNA，2.5 μl of 10X buffer, 0.3 μl of 10 mM dNTPs, 1 μl of50 mM MgCl2, 两个引物各1 μl, 1 unit Taq酶。PCR 反应程序是 94 ℃5 分钟（初始变性)；然后 94 ℃40 个循环1 分钟， 55 ℃1 分钟， 72 ℃ 3 分钟最后72 ℃5 分钟。RG100引物位点为5-GCT GGA CGT GCC AAA GAG AG-3(向前) and 5-CGA ACC ACA GCC ACA GCA TG-3 (相反)， 预期的PCR产物大小为0.95 Kb5-GGC GGC GAG AGG ATC GAG AC-3向前) 和5-TCG GCG GGA CGT TGT TGT TC-3（反向）预期的PCR产物大小为 Kb (Ghareyazie etal