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土壤蛋白酶活性测定(茚三酮比色法) 实验试剂： 1、pH7.6的0.05mol/L的tris—HCL缓冲液(三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液):50ml0.2mol/L的三羟甲基氨基甲烷与27.5ml0.2mol/L的盐酸混合,稀释成200ml。 2、2%酪酸钠溶液:称取2g 酪酸钠,加入10ml0.1mol/L的NaOH溶液,沸水浴处理5min,待膨化后加入pH7.6的tris—HCl缓冲液约80ml,继续沸水浴处理,直至完全溶解,用同样的缓冲液定容至100ml。 3、Tris—HCl—CaCl2混合溶液:用pH7.6的0.05mol/Ltris—HCl缓冲液配制的0.01mol/L的CaCl2溶液。 4、0.6mol/L乙酸铅溶液。 5、草酸钠—乙酸混合溶液:每1000ml0.26mol/L的草酸钠溶液含有240.7ml0.2mol/L的乙酸。 6、茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂:称取2g茚三酮,0.02g 抗坏血酸,溶于100ml无水乙醇。 7、0.2%KIO3溶液。 8、pH5.8乙酸—乙酸钠缓冲液:94 ml0.2mol/L乙酸钠与6ml0.2mol/L乙酸混合。 9、0.01%甘氨酸标准溶液:1g甘氨酸溶于1000ml水,再稀释10倍。 10、甲苯。 以上试剂均为分析纯。 实验仪器: 基本仪器如试管、烧杯等、离心机、分光光度计、刻度试管、水浴锅、电子天平、移液管 实验步骤 标准曲线的绘制 分别吸取50 、100、150、200、250、300μl0.01%甘氨酸标准溶液,置于10 ml刻度试管中(浓度分别相当于NH2 0.107、0.213、0.320、0.426、0.533、0.639μg/ml),加入2mlpH5.8的乙酸—乙酸钠缓冲溶液 加入1.5ml 茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂,混合均匀,沸水浴加热16min 取出立即用自来水冷却15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均匀,用蒸馏水定容至10ml,1h内在570nm处比色测定吸光值;以氨基氮(NH2)的浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。 2、培养与测定 ① 称取0.200g土壤,加入2mlTris—HCl—CaCl2混合溶液和1ml甲苯,混合均匀后静置15min以抑制微生物活性； ② 然后再加入5ml2%的酪酸钠溶液,50℃振荡培养2h。对照土壤在培养过程中不加酪酸钠溶液,但在培养结束后加入,且加入的酪酸钠也经历50℃、2h的振荡培养过程。 培养结束并在对照中加入酪酸钠后,充分混合,置于0～4℃冷藏柜中静置30min。 取出加入1.5ml0.6mol/L乙酸铅溶液,6000r/min离心10min,取上清液1.5ml,加入457μl草酸钠—乙酸混合溶液,17000r/min再离心10min； ⑤小心吸取1ml上清液，置于10ml刻度试管中,加入2mlpH5.8的乙酸—乙酸钠缓冲溶液,再加入1.5ml茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂,混合均匀,沸水浴加热16min,取出立即用自来水冷却15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均匀,用蒸馏水定容至10ml,1h内在570nm处比色测定吸光值。 注:每个土样设置5个重复。 结果计算 NH2(μg)=a×150 式中,a为比色液吸光值在标准曲线上对应的浓度,单位为(NH2μg/ml),150为换算为每个样品NH2总含量的系数。 蛋白酶的活性以50℃培养2h,5g土壤中NH2的μg 数表示(为便于比较,也可以换算为1g烘干土,表示为NH2μg/g烘干土)。 芳基硫酸酯酶的活性测定（比色法） 1. 方法原理：芳基硫酸酯酶酶促有机硫化物脱硫成为无机形态。基于碱性条件下，芳基硫酸酯酶作用n-硝基酚硫酸酯，比色测定水解生成的酚量表示酶的活性。 2. 药品及试剂配置： 对硝基酚硫酸钾，醋酸，CaCl2·2H2O,NaOH，对硝基酚，甲苯 ⑴ 0.005 mol/L 对硝基酚硫酸酯溶液： 0.1287g 4-硝基苯硫酸钾（对硝基苯基硫酸钾）溶于醋酸缓冲液（Ph=5.8），并用同一缓冲液将溶液定容至100 mL 溶液保存在冰箱中。 ⑵ 0.5 mol/L醋酸缓冲液（Ph=5.8） ⑶ 0.5 mol/L CaCl2·2H2O ⑷ 0.5 mol/L NaOH ⑸ n-硝基酚标准溶液：取1 g 对硝基酚溶于水并定容至1 L (1 mL含1 mg) 标准曲线的绘制：取1 mL 对硝基酚标准溶液稀释至100 mL（1 mL含10 ūg），然后取不同量的稀释液配成系列，用以测定芳基硫酸酯酶活性相同的方法，使对硝基酚显色，比色后制成标准曲线。 3. 操作步骤： 加几滴甲苯