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任务三：发酵罐实消、接种 子任务二；发酵罐接种 引导课文 通过本任务的学习你应该能够掌握下列知识： 1．掌握小型发酵罐无菌接种的原理和方法。 2．理解杂菌污染的途径和防治方法。 3. 掌握接种安全操作规程 通过操作训练你应该具有下列能力： 1. 能进行发酵罐无菌接种操作。 2．对接种异常问题能及时预见、反应、处理。 3. 能严格按照安全操作规程进行操作。 前面我们已经制备了符合要求的产黄青霉菌种子，进行了发酵罐的清洗及空消、实消，接下来的任务就是进行接种了，那么发酵罐接种的知识你了解多少呢？ 一、无菌接种的必要性： 案例：山东省某大型制药企业的2号发酵生产车间连续发生染菌污染事件，且每次杂菌的种类基本相同，分析可能染菌的原因，提出检查方案和防治措施。 分析：若排除了管路灭菌、空消、实消不彻底而导致染菌的因素外，能导致污染的另外一个原因就是接种操作不规范引起的。我们的发酵属于纯培养，是由单一菌种接种以 后进行的培养，其中不可以有任何杂菌，否则会影响产品的使用效果，所以为了确保每一批发酵的成功，在上罐之前，发酵人员必须具备以下两种意识： 无菌意识 安全意识 二、接种量的确定 接种量指移入的种子液体积与接种后培养液体积的比例 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或过小，均会影响发酵。接种量过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而却会过多移入代谢废物；接种量过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。 通常接种量：细菌1-5%，酵母菌5-10%，霉菌7-15%，有时20-25%。 二、发酵罐接种的方法 一般情况下，发酵罐接种有三种方法：①火圈直接倒种②注射器接种③压力差接种。前两种方法适用于小型发酵罐，第三种方法适用于大型工业化生产发酵罐。 1、火圈直接倒种法操作规程如下： 当发酵液温度降到接种温度时即可进行接种。 准备合格的摇床菌种。 用酒精棉擦洗罐顶接种口，并在接种口四周围上酒精棉。接种者的双手也需用酒精棉擦洗消毒、晾干。 调进气阀，减少进气量（不能关闭，否则罐压跌零，引起污染），拧松接种口螺母；检查罐内压力是否在0.01MPa以下（如不在应开大排气阀或调进气阀，减少进气量），点燃接种口四周的酒精棉；拧下接种口螺母，并将其放入预先准备的盛有酒精的培养皿中。 将菌种瓶的瓶口在火焰上烧一会儿，并在火焰下拔下瓶塞，迅速将菌种倒入发酵罐内。 盖上接种口螺母，灭火焰，拧紧螺母；并用酒精棉将接种口擦洗干净。 调节进气阀及排气阀，达到工艺要求的通气量及保持罐压。 2、注射器接种法： 灭菌及罐压调节都同于火圈直接倒种法。此时准备无菌注射器，预先在超净台上将菌种液体吸入注射器内，无菌操作将菌种注射入发酵罐内。此种方法尤其适合于微小型发酵罐（容积在5L）以下。 3、压力差接种： 移种前应先路内的冷凝水随时可以排空。 移种时在关闭蒸汽阀后应当立即进行移种，避免造成负压污染。 采用压差移种即P小大于P大，移种前对移种管道、阀门蒸汽灭菌20min，P小0.05 Mpa，P大0.03Mpa，打开移种管道上的阀门，通过压差作用转罐，移种结束后立即关闭移种阀，然后打开与之联通的蒸汽阀通入蒸汽进行冲刷消毒，并立即清洗种子罐，防止发酵料粘结在管道阀门及罐壁上，消毒后立即关闭蒸汽阀门和排冷凝水的阀门及管帽。 三、我们实验室发酵罐接种操作及注意事项 注意事项： 环境：关闭车间门窗和排气扇，接种环境周围禁止人员来回走动，降低空气流动性； 无菌：倒摇瓶需靠在火焰附近，三角瓶不可倾斜过度，避免种子液流出；接种操作过程中罐压不能掉零； 安全：三角瓶靠近火焰倾倒，但需注意操作人员应离开火焰一段距离，穿好防护服，严禁穿羽绒服、尼龙等易燃衣物；女生不可披头发、带丝巾操作；点燃火焰圈不可随处乱扔，熄灭以后才可以继续操作。 准备操作 准备好接种所需材料 关闭门窗、排气扇 操作人员合理分工，一个为主操作，一个为副操作 消毒 副操作用酒精棉擦拭接种口进行消毒 消毒以后用火焰保护好接种口 接种 本系统采用火焰封口接种，接种前应事先准备：酒精棉花、钳子、镊子、接种环、石棉网手套、Z字扳手。 菌种装入三角烧瓶内，接种量根据工艺要求确定。 将酒精棉花围在接种环周围点燃，将菌种瓶口在火焰上烧一会儿，用Z字扳手拧开接种口，迅速将菌种倒入罐内，此时应向罐内通气，使接种口有空气排出（压力接近与零，但不能为零）。 将接种口盖在火焰上灭菌后拧紧。接种后，罐压保持在0.03-0.07Mpa（0.05Mpa），调节通风量。 消毒 副操作用酒精棉擦拭接种口消毒以后迅速盖上接种盖，设置好参数后进行培养 任务工单 任务：阅读完引导文后，请结合网络资料查阅设计我