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熒光分光光度法测定维生素B2的含量
荧光分光光度法测定维生素B2的含量
实 验 报 告
——应用化学(环境检测与分析)
一、实验目的
1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。
2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能,掌握其基本操作。
二、实验原理
1什么是荧光?
荧光是光致发光。当物质的分子接受光子能量被激发后,从激发单重态的最低振动能级返回基态时发射的光。
2
3 荧光与环境因素的关系
取代基的性质、溶剂的极性、体系的pH和温度。
维生素B2(Vitamin B2),别名:核黄素(Riboflavin,RF),是橘黄色无臭的针状结晶,分子式:C17H20N4O6 ,相对分子量为:376.37。因其色黄且含有核糖醇,故称为核黄素。结构式为:
由于分子中有三个芳香环,具有平面刚性结构,因此它能够发射荧光。维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂,在中性或酸性溶液中稳定,光照易分解,对热稳定。
维生素B2溶液在430—440nm蓝光的照射下,发出绿色荧光,荧光峰在535nm附近。维生素B2在pH=6—7的溶液中荧光强度最大,而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系,因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素,光黄素也是一个能发荧光的物质,其荧光比维生素B2的荧光强得多,故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内,且在避光条件下进行。
在稀溶液中,荧光强度F与物质的浓度c有以下关系:
F=2.303ФI0εbc
当实验条件一定时,荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系:
F=Kc
这是荧光光语法定量分析的依据。
三、仪器与试剂
1、主要仪器:荧光分光光度计(日立F—7000);比色皿:1cm;容量瓶:50mL;移液管:5mL。
2、试剂:核黄素;维生素B2药片
四、实验步骤
1. 溶液的配制
标准溶液的配制:精确称取2 mg核黄素(VB2),用超纯水于50ml棕色容量瓶中定容
待测液的配制:将维生素B2药片研磨成粉末状,精确称取2mg,用超纯水于50ml棕色容量瓶中定容;
2. 扫描激发光谱和荧光光谱
3. 标准曲线的绘制
在室温条件下,分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0标准溶液于50ml棕色容量瓶中定容。用超纯水作空白试样,测定溶液荧光强度值。用所测结果绘制荧光强度(F)对浓度(c)的曲线。
4. 待测液VB2含量的测定及数据处理
五、实验结果及数据处理
λex=442nm
λem=524nm
VB2标准曲线及药片中VB2含量的测定(大浓度)
VB2标准曲线及药片中VB2含量的测定(稀释到中间浓度)
六、总结、讨论
1、实验注意事项:
(1)配制标准溶液时,为了减少仪器偏差,取不同体积的同种溶液应用同一移液管。
(2)因荧光是从石英池下部通过,所以拿取石英池时,应用手指捏住池体的上部,不能接触下部。清洗样品池后,应先用吸水纸吸干四个面的液滴,再用擦镜纸往同一方向进行轻轻擦拭。
(3)在使用荧光分光光度计时,须按照既定程序进行。在测定系列标准溶液的浓度和荧光强度时,必须按顺序放入测定。
(4)在测试样品时,应注意样品的浓度不能太高,否则由于存在荧光猝灭效应,样品浓度与荧光强度不呈线性关系,造成定量工作出现误差。
2、此次实验,影响标准曲线的线性的主要因素是配制溶液时,操作是否规范、标准。
七、思考题
1、试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因?
答:由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力,并且荧光强度与激发光强度成正比,提高激发光强度也可以增大荧光强度,使测定的灵敏度提高;而吸收光度法测定的是吸光度,不管是增大入射光强度,还是提高检测器的灵敏度,都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大,吸光度值不会改变,因此灵敏度不能提高。
2、维生素B2在pH=6~7时荧光最强,本实验为何在酸性溶液中测定?
答:因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射,会发生分解而转化为光黄素,后者的荧光比维生素B2的荧光强的多。因此,测量时溶液要控制在酸性范围内进行。
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