生化技術实验考试重点.docVIP

721分光光度计 构成 5个基本部件：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表 原理 溶液中的物质在光的照射激发下产生对光吸收的效应，不同的物质都具有其各自的吸收光谱，在一定条件下当某单色光通过溶液时，其吸收程度与该物质的浓度成正比，且入射光越强、溶液浓度越大、液层厚度越厚时，溶液对光的吸收越多，它们之间的关系符合朗伯-比尔定律 理论基础 朗伯-比尔定律：讨论吸收光能与溶液浓度和溶质层厚度之间的关系的基本定律 I：透过光强度 I0：入射光强度 T：透光度 T=I/I0 百分透光度（T%）=T×100 透光度的负对数为吸光度 A=lgT=lgI/I0 A=kbc k：比例常数（吸光系数） c：浓度 b：液层厚度 实验项目 波长校正 线性检查 杂光检查 比色皿的质量检查 重复性检查 对721分光光度计进行一些机械调整，改变光源与单色器的相对位置，使其处于同一直线上，保证波长读数与通过样品的波长符合，确保仪器的最大灵敏度。 线性误差：表现为溶液的浓度与吸光度不成线性关系，出现正或负偏离的现象 原因：?是溶液本身不符合比尔定律（化学偏离） ?仪器本身各种因素的影响（仪器偏离） 凡检测器感受到的不需要的辐射都称为杂光。 杂光的来源有：①仪器本身的原因②室内光线过强而漏入仪器，仪器暗室盖不严；③样品本身的原因 材料：玻璃、石英或荧石制成 光径：1.0cm或0.5cm 影响比色皿的质量：原材料、皿壁的厚度是否均匀、上下光径是否一致、各皿彼此是否相配 对同一标本进行多次测量结果的一致程度。意义：重复性的改变可对分光光度计的检测结果造成误差。 方法/内容 镨钕滤光片校正法（529nm） 包括仪器线性及测定方法线性 在可见光区可使用镨钕滤光片法检查。 蒸馏水法 步骤 粗调：预热→波长度盘（580nm）→T%调至最大→在比色杯处放一白纸条→光强均匀、边缘无光晕或杂光的光斑→调节灯泡位置使其符合上述要求 细调：灵敏度“1”（最低档）→显示器表盘读数T% 为零（在光路空白时调T%为100%T）→反复查零点和100%T稳定情况→将镨钕滤光片插入光路→慢慢旋转波长度盘，找到透光率值最低点（向左右微旋波长度盘时，该点透光率值均增加），这一波长即为529nm→波长度盘529nm 波长校正螺丝：正误差逆时针，负误差顺时针 1、用一种在一定波长及一定浓度范围内确知其服从比尔定律的有色物质，配成不同浓度的溶液，来检查仪器本身是否能如实地反映有色物质的浓度变化。 2、这种检查方法不受分析方法本身误差的影响。用测得的吸光度对浓度作图，在理想情况下应是一条直线。 3、500mg/L重铬酸钾储存液→100、200、300、400、500mg/L的溶液→440nm波长→蒸馏水调零→以为纵坐标，为横坐标作标准曲线 →加样→电泳→剥胶→固定、染色→漂洗 制胶 加样 电泳 剥胶 固定、染色 漂洗 玻璃管→一端塞好垂直放→加分离胶溶液至7cm→继续加蒸馏水至7.5cm→静置1h→倒去蒸馏水→加浓缩胶至7.5cm→再加0.5cm蒸馏水→静置1h 小试管中加入血清与上样缓冲液（溴酚蓝）比例为1.5：1混合后取40ul加在浓缩胶表面，再以少量电极缓冲液覆盖之。 （1）将加好样品的凝胶管，除去底部橡皮垫，垂直插入电泳仪上槽的橡胶塞孔中，使凝胶顶部正好可见。 （2）加入电极缓冲液于上、下电泳槽中，上槽液浸没凝胶管，勿搅动样品，凝胶管下端浸入下槽液中，用注射器排除凝胶下口存在的气泡。 （3）将上槽电极接电泳仪负极，下槽电极接电泳仪正极。接通电源，调节电流控制在2~5mA/管、待溴酚蓝进入分离胶时，调节电流为2mA/管，当溴酚蓝距凝胶管下口0.5~1cm处时，关闭电源。 用带长针头的注射器，注射器 内吸满水作润滑剂，将针头插入 胶柱与玻壁之间， 边注射水边旋转玻管，直到胶柱与管壁分开，然后 用洗耳球轻轻在胶管一端加压，使凝胶缓缓从管中 滑出。 为防止凝胶内已分离的蛋白质成分扩 散，将胶柱浸泡于固定液中固定15分钟，然后转入 染色液中染色60分钟。 染好色的凝胶置于洗脱液中漂洗，经常更换 洗脱液，直至洗脱液呈无色为止。 应用 聚丙烯酰胺凝胶电泳是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术。 注意事项 Acr和Bis是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，制胶过程中一定要戴手套 氨 基 酸 双 向 纸 层 析 原理 纸层析法是用滤纸作为支持物的分配层析法。根据不同的氨基酸在固定相与流动相中分配系数不同，层析时，不同氨基酸在滤纸上的移动速度不同而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度以迁移率Rf值表示。 支持物：滤纸 固定相：滤纸上吸附的水