生命科學生物技术大实验指导.docVIP

实验一 应用TRIzol提取病毒RNA 实验目的 1.了解Trizol法分离总RNA的原理和方法。2.掌握提取、分离总RNA的方法。 原理 TRIzol（Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂。异硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物。在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。?????TRIzol试剂可用于小量样品（50－100mg组织、5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107个细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的稳定性。 仪器高速低温高心机， Eppendorf离心管。 试剂 TRIzol 试剂、氯仿、75%乙醇（0.1%?DEPC配制）1%?DEPC 、异丙醇 所提取物为感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的细胞中的病毒。所用一切物品无RNA酶。在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500?l，再加入TRIzol 溶液 500?l，充分混匀，室温放置10min。加入200?l的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10min （由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心）。3. 离心 4℃、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。4 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。 离心 4℃、13000r/min、15min，小心吸去所有上清。底部有RNA，操作需小心。1ml 75%乙醇洗一遍，离心 4℃、8000r/min、10min。小心吸去所有上清，在超净台中干燥 5min。 加入适量DEPC处理水(建议立即做RT-PCR。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后则只能在－20℃保存1个月左右。)。 注意事项 操作时必须戴手套。 所用的器皿和试剂均须经 DEPC水处理或 250－300℃干烤4h。Trizol reagent、氯仿、DEPC水是剧毒物质，要注意防护。 逆转录反应 实验目的 掌握RNA逆转录扩增cDNA的方法和原理 原理RT-PCR是指将逆转录(Reverse Transcription；RT)反应和PCR (Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的方法。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成，它是一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT- PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他 RNA分析技术更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT) 或基因特异性的引物起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。三、实验仪器和试剂 仪器 PCR仪、离心机、灭菌的PCR管、移液器等 试剂 实验一中提取的总RNA ；随机引物及Oligo（dT）；逆转录酶；dNTP；RNA酶抑制剂 四、实验步骤 1. 在冰浴离心管里面加入模板RNA 4?L，引物2?L，去离子水5?L，混匀，离心3-5秒；2. 70℃水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；3. 加入5×反应液4uL，RNase抑制剂1?L，dNTP 2?L（这些应该先配好，然后分再装到每一管），混匀； 4. 37℃水浴5分钟，加入1?L AMV-RT反转录酶，混匀； 5. 37℃水浴1小时（此步是反转录过程）； 6. 70℃10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70℃保存。 五、注意事项 1. 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 2. 操作人员实验过程中手套要勤换。 3. 加入试剂之前把它混匀一下以免放置时间长了浓度不均聚合酶链