硫酸銨微生物限度检查方法验证.docVIP

硫酸铵微生物限度检查的 方法验证 1.验证目的： 建立硫酸铵的 金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003 第 3 代 来源：江苏省药品检验所 大肠埃希菌CMCC（B）44 102 第 3 代 来源：江苏省药品检验所 枯草牙胞杆菌CMCC（B）63 501 第 3 代 来源：江苏省药品检验所 白色念珠菌 CMCC（F）98 001 第 3 代 来源：江苏省药品检验所 黑曲霉 CMCC（F）98 003 第 3 代 来源：江苏省药品检验所 3.1菌液制备： 3.1.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草牙孢杆菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，30-35℃培养 24 小时； 3.1.2接种白色念珠菌的新鲜培养物少许接种至改良马丁培养基中，23-28℃培养 48 小时； 3.1.3接种黑曲霉的新鲜培养物少许至改良马丁琼脂培养基中，23-28℃培养 5 天。 3.1.4取经30-35℃培养 24 小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草牙孢杆菌营养肉汤培养物1ml，加9ml0.9%氯化钠溶液，10倍稀释至约 10-5～10-6 ，备用。 3.1.5取经23-28℃培养 48 小时的白色念珠菌改良马丁培养基培养物1ml，加9ml0.9%氯化钠溶液，10倍稀释至约 10-5 ，备用。 3.1.6取经23-28℃培养 5 天的黑曲霉改良马丁琼脂培养基斜面培养物，加入4ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液，洗脱孢子，吸出并转移至空试管作为原液，取1ml加入含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液9ml，10倍稀释至 10-4 ，混匀备用。 4.细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证（平皿计数法） 验证试验至少应进行三次独立的平行实验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 4.1试验组 取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。 .2菌液组 测定所加入的试验菌菌数。 4.3供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 4.4稀释剂对照组 若供试品制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 .5菌回收率计算 试验组的菌回收率（%）= -供试品对照组平均菌落数 100% 菌液组平均菌落数 稀释剂对照组的菌回收率（%）= ×100% 菌液组平均菌落数 4.6结果判断 在3次独立的平行试验中，若稀释剂对照组的菌回收率和试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 5.控制菌检查方法验证： 5.1试验组 取规定量供试液及50～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。 .2阴性菌对照组 方法同试验组，验证大肠埃希菌的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌。 5.3结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备方法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 5.4验证结果：（见续页2） 6.结论： 本品按中国药典2010年版部附录X微生物限度检查法进行方法验证，结果10g，使成1：10的供试液；可采用1：10的供试液对大肠埃希菌进行检查。 1） 硫酸铵 批号20110510 规格 1Kg/瓶 包装 塑料瓶 数量 各60g 生产单位 德国默克公司 检验依据 中国药典2010年版部附录 供试液 制备 取供试品10g， 菌种 项目 平均菌落数（cfu/皿） 回收率%（应≥70%） 2 3 1 2 3 金黄色 葡萄球菌 试验组 63 68 66 81 87 85 稀释剂对照组 / / / / / / 供试品对照组 0 0 0 / 菌液组 78 /