《病毒包装实验整体流程及原理.docVIP

病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1） 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难以转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。? 2） 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3） 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4） 无需任何转染试剂，操作简便。 5） 可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2） 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3） 培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4） 病毒的纯化和浓缩。 5） 分装、- 80 ℃保存。 6） 滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1） 几乎可以感染所有类型的细胞 2） 可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3） 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4） 腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5） 感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1） 构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2） 采用 PacI 消化纯化的质粒。 3） 消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4） 将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5） 分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较 慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较 病毒表达系统 慢病毒表达系统（Lentivirus） 腺病毒表达系统（Adenovirus） 病毒基因组 RNA病毒 双链DNA病毒 复制 自主复制 自主复制 是否整合 病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因 病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因 感染细胞类型 感染分裂和不分裂细胞，适用于难转染的原代细胞（如神经细胞）及体内实验 感染分裂和不分裂细胞 表达丰度 中水平表达 高水平表达 表达时间 慢（1-3天） 快（1-2天） 滴度 滴度最高可达10*8pfU/ml 滴度最高可达10*11pfU/ml 克隆容量 可插入不超过8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低 可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低 免疫原性 低免疫原性 高免疫原性 2、构建目的基因到载体 2.1构建手段 一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。 1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定 2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定 2.2质粒载体 2.2.1概念 能够进行自主复制的环状DNA双链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子 2.2.2特征 质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制。通过这些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利