Takara實验技能讲座之Westernblot.pptVIP

T7101A也能用于CCD，信号时间短 一般发光时间是30-60 min，线性关系好。 电泳结果 电泳结果 Sample：Human Transferrin（50、25、12.5、6.25、3.12、1.56 ng／レーン） Blocking ：Western BLoT Blocking Buffer (Protein Free)（製品コード T7132A） 一抗： Goat anti-Human Transferrin affinity purified（終濃度0.5 μg/ml） 二抗： Affinity Purified Antibody Peroxidase Label Rabbit anti-Goat lgG (H+L) （終濃度0.1 μg/ml） 抗体稀释：抗体稀释溶液情况如下： 发光基质：Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate（code：T7101A） 洗浄液 ：TBS-T（組成：10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1％ Tween 20, pH7.6） 使用本试剂 1、用于对同一张膜上的样品中不同蛋白抗原的表达丰度进行检测。当针对第一种蛋白进行抗原-抗体反应和化学发光检测后，使用本制品，在室温条件下反应30分钟，能够剥离反应后的一抗和二抗。然后，重新针对另外一种蛋白进行抗原-抗体反应，通过化学发光底物检测该蛋白的丰度。 2、当样品很少时，也可以用于探讨抗体适宜的稀释倍数。 9300：?標準プロトコール（1ml反応系／200 μl反応系） ： 定量範囲50～2,000 μg/ml ?低濃度測定プロトコール（1ml反応系／200 μl反応系） ： 定量範囲～50 μg/ml 9310：?標準プロトコール（1ml反応系／200 μl反応系） ： 定量範囲25～1,000μg/ml ?低濃度測定プロトコール（1ml反応系／200 μl反応系） ： 定量範囲1～25μg/ml * * Western blot步骤 * 一抗孵育 二抗孵育 一抗孵育 一抗的选择 抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别多个抗原决定簇的多克隆抗体。另外有的抗体识别一级结构，有的抗体识别立体结构，后者不能与变性或还原的蛋白质结合。制备抗体时，如果免疫原是变性蛋白，那么制备的抗体只能与变性蛋白结合，不能与天然蛋白质结合。 用于Western Blotting的一抗一般都有销售。购买抗体时要考虑以上几点，选择抗体时，对同一个抗原的不同类型抗体在产品数据上进行详细调查后再购买，尽量使用特异性高的单克隆抗体。 反应方法 减少失败的最好方法是将高度稀释的低浓度抗体溶液添加到托盘中，放入膜后，4℃缓慢摇动过夜孵育。如果抗体使用量有限制，建议使用杂交袋，使用杂交袋时要确保不能有气泡。 * 使用一抗进行目的蛋白的检测。 抗体查询 * http://www.takara-bio.co.jp/antibody_search/antibody_search.php 抗体种类 细胞间连接、钙粘着蛋白抗体 细胞外基质关联 骨代谢关联 血小板关联 信号传导关联等 疾病相关抗体（IBL） His标签抗体 二抗孵育 二抗的选择 可从不同宿主获得的二抗，如果背景较高，使用另一种宿主的二抗可减少背景。还销售宿主以外的对动物种属来源血清蛋白进行吸收操作的抗体。确认动物种属后根据检测方法选择合适的抗体。 一般使用HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗进行化学发光检测的方法。其它还有使用AP（碱性磷酸酶）标记抗体（对发光物质进行检测）、荧光物质及放射性同位素标记的二抗。 * 使用二抗进行一抗的检测。二抗孵育前应进行点杂交预实验，研讨二抗的正确使用量。 Western blot 快速检出试剂（二抗替代物） -- Western BLoT Rapid Detect v2.0 * 短时间内有效的进行抗体反应，可以使用Rapid操作方法 提高检出感度，IgG Detector标记50个HRP分子增加信号强度。 动物种HRP标记二抗替代物（检测Mouse IgG时需要使用Enhancer，不能替代goat IgG、human IgG3二抗） Western BLoT Rapid Detect v2.0 T7122A 50 次 3170 元 Western blot步骤 * 检测 化学发光检测 检测(化学发光?显色) 按照各试剂的操作流程进行重复操作，研讨最佳实验条件。 将转膜后的膜放置在保鲜膜上，将检测试剂滴加在膜上，确保试剂均匀覆盖在膜上。 因目的蛋白的浓度和使用的抗体浓度不同，胶片曝光条件也不同，因此要进行预研讨实验。 在发光持