【2017年整理】抗体HRP标记方法.docVIP

HRP标记抗体的方法(戊二醛二步法和简易过碘酸钠法) 一、戊二醛二步法?戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。二、简易过碘酸钠法?本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70%的?HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。 1. 原理 戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 2. 标记步骤 （1）称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 （2）反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。 （3）将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 （4）用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。 （5）加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 1小时。 （7）3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。 （8）将上述