轉马铃薯Y病毒复制酶基因烟草的获得及抗病性分析.docVIP

转马铃薯Y病毒复制酶基因烟草的获得及抗病性分析* 1 郑云泽2 贝纳新1 孙淑英2 李浩戈1 王振东1 (1 沈阳农业大学生物技术中心 辽宁 11061) (2 辽宁省烟叶生产供应公司) DNA用KpnI/BamHI双酶切得到马铃薯Y病毒NIb基因，将其插入质粒pRok2相应切点中构成植物表达载体。用重组质粒pRok2转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404菌株，叶盘法将基因NIb转入烤烟品种NC89的染色体，获得抗卡那霉素的转化再生植株。经抗性筛选、PCR检测、无性扩繁和大量重复抗病鉴定，结果表明，转化烟草植株DNA中整合了外源目的基因，且表现抵抗20μg/mlPVYNELISA分析认为抗性植株无病毒累积，初步筛选出对PVYN 　　主题词 马铃薯Y病毒脉坏死株系 复制酶基因 转基因烟草NC89 抗病性 Beachy[1]等首先将烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因转入烟草，获得了抗TMV的转基因烟草植株。此后不少研究结果[2]RNA所介导的抗病性，对不同植物病毒抗病效果差异明显，多数仅能降低染病植株的病毒含量、推迟发病时间或减轻症状。1992年以来，国外相继报道了利用病毒编码的复制酶(亚基)或相关cDNA片段转化烟草，获得了高抗TMV、PVX和CMV等工程植株[3,4,5,6] 　　马铃薯Y病毒脉坏死株系(Necrotic strain of potato virus Y, PVYN)是我国烟草种植区流行的优势病毒，对烟草生产已造成显著的影响[7]Y病毒分子生物学研究表明，该病毒具有约为10kb的单链正义RNA基因组，其基因组翻译和表达策略采取聚合蛋白加工形式，即该病毒有一个大的开放阅读框架(ORF)，可翻译成一个大的蛋白，然后通过加式切割成为较小的不同功能多肽，其中核内含体大分子量蛋白(Nuclear Inclusion protein b,NIb)被认为是依赖于RNA的RNA复制酶[8]PVY的NIb基因在植物中的表达，赋予植物抗病毒能力，尚待探讨。作者克隆了PVYN NIb基因，在序列分析及国外报道的其它株系比较的基础上，构建了其植物表达载体，并获得了对PVYN 　　1 材料与方法 1.1 酶及试剂 PCR扩增试剂盒购自华美生物工程公司，[α-32P]dCTP为Amersham产品，限制性内切酶及其它工具酶均购自华美生物工程公司。实验中所用其它化学试剂均为进口或国产同类分析纯产品。PCR引物由中国科学院微生物研究所技术室合成。 1.2 毒原、菌种与质粒 MC1022和农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404及质粒pZD-1和pROK2均由中国科学院微生物研究所病毒室提供。 1.3 植物表达载体构建 KpnI/BamHI从重组克隆pZD-1切下NIb基因，将其插入pROK相应切点中转化大肠杆菌MC1002菌株。以碱法提取质粒DNA，用BamHI/KpnI双酶切及用一对PVYN -NIb基因引物进行PCR鉴定重组克隆。 1.4 农杆菌转化 [9]方法转化农杆菌LBA4404，用PCR鉴定重组克隆。 1.5 烟草转化 NC89。 1.6 转基因烟草的检测 Northen blot对转基因烟草进行检测。按文献[10]RNA，用[α-32P]dCTP标记的pZD-1 BamHI/KpnI片断为探针进行杂交[11] 　　1.7 转基因烟草的抗病性鉴定 5~6片叶时，汁液摩擦接种，以未经农杆菌转化的再生烟草NC89为对照，病毒接种浓度为20μg/ml。 (Indi-ELISA)检测接种烟草植株的病毒侵染和累积状况。 2 结果 2.1 重组pROK2的酶切图谱及PCR BamHI/KpnI双酶切，可从重组pROK2中切下1.5kb的DNA片段，见图1。从重组pROK2中还可通过PCR扩增出1.5kb的DNA片段，见图1。这一结果说明，NIb基因已组装到植物表达载体pROK2中。 2.2 重组农杆菌的PCR检测 PCR可从重组农杆菌中扩增出1.5kb的DNA片段，见图2。这一结果说明NIb基因已被导入农杆菌LBA4404。 2.3 烟草叶片组织的转化和再生 NIb基因的烟草叶片愈伤组织产生及出芽分化过程见图3~5。 2.4 转基因烟草的Northen分析 Northen blot结果表明，部分转基因烟草植株中含有NIb基因。 2.5 转基因植株抗病毒性 5~6叶时接种20μg/ml PVYN10天对照全部(50株)发病，表现PVYN35株有8株抗病。攻毒30天后第2次调查，表现抗性的8株中又有4株也开始呈现支脉褐变，但此对照植株和先期发病的转基因植株叶脉已经严重坏死。另4个抗性植株至开花期及以后均无症状出现，长势良好。 2.6 转化再生烟草植株PVYN 　　用间接酶联