大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化[精选].ppt

大肠杆菌中高效表达的蛋白，常常以不可溶解包涵体存在； 包涵体是由错误折叠的多肽形成的致密、非晶体性的蛋白沉淀物，其一级结构（即氨基酸序列）是正确的，立体结构是错误，所以没有生物活性； 包涵体能够溶解于强的变性剂，如8 mol/L脲或6-7mol/L盐酸胍溶液中。 思考题 蛋白质的CD光谱与其分子构象有何关系？圆二色性光谱法可以为蛋白质分子构象提供哪些信息？ 蛋白质的紫外光谱与其分子构象有何关系？该方法可以为蛋白质分子构象提供哪些信息？ 你能否通过关键词，查阅和设计一个有功能细胞因子从基因克隆、表达与复性的实验？ 参考文献 Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation with simultaneous purification of rhG-CSF from Escherichia coli by ion exchange chromatography.Biome Chromatogr., 2007,21: 1291-1296 Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor produced from Escherichia coli using size exclusion chromatography, J Liquid Chromatogr. Related Tech., 2006, 29:203-217 Wang CZ, Wang LL, Geng XD. High recovery refolding of rhG-CSF from escherichia coli using urea gradient size exclusion chromatography. Biotechnol.Progr., 2008, 24(1): 209-213 Clark ED.Protein refolding for industrial processes. Curr Opin Biotechnol. 2001; 12(2):202-207. Singh SM, Panda AK. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng, 2005, 99(4): 303-310. Geng XD, Wang CZ. Protein folding liquid chromatography and its recent developments. J Chromatogr B, 2007, 849: 69-80. Geng XD, Wang LL. Liquid chromatography of recombinant proteins and protein drugs. J Chromatogr B, 2008, 866: 133-153. 罗丹明基“OFF-ON”型荧光探针对金属离子的识别特性及其生物学应用（选修） 请预习下一个实验 实验五 《化学生物学》实验课程组 李剑利 * 大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化 创新实验I-化学生物学 化学生物学实验课程组 王骊丽 实验四 NORTHWEST UNIVERSITY 化学国家级实验教学示范中心 基因工程操作：基因扩增、表达；原核细胞；包涵体的形成与特点。 重组蛋白分离纯化：细胞收集 、破碎；包涵体的溶解； 蛋白质变性、复性：稀释法、透析法、蛋白质折叠液相色谱法； 蛋白质构象的表征：包涵体构象变化、圆二色谱法 实验技能训练要点 主要新知识 仪器分析：色谱技术 –液相色谱技术…… 仪器分析：光谱技术-荧光光谱、核磁共振 …… 化学生物学导论：蛋白质、酶…… 蛋白质与酶化学：重组DNA技术…… 蛋白质纯化与表征：液相色谱法、蛋白质构象表征….. 有机化学：荧光探针 实验技能训练要点 主要知识回顾 背景知识 实验室研发从E.coli 中得到一个具有活性的治疗用药物蛋白或者研究用蛋白纯品，包括以下步骤： ①目的基因DNA片段的获得；②E.coli 重组表达载体的构建；③在E.coli 中对目的基因进行表达；④目的蛋白从E.coli 裂解液中的纯化；⑤规模化生产工艺（包括工程菌发酵、复性与纯化工艺的放大等）的建立。 关键词：重组人粒细胞-集落刺激因子、液相色谱复性与纯化 Recombinant human granulocyte colony stimulating factor, Renaturation and purification by li