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B.10. 诱变(性)-体外哺乳动物染色体变异测定1.方法这种方法是对1997年进行的试管中哺乳动物染色体异常测定的(the OECD TG 473)的复制。1.1. 引言体外哺乳动物染色体异常实验的目的是证实在人工培养的哺乳动物细胞(1)(2)(3)中能诱发染色体结构异常的媒质的存在。结构性异常存在两种方式:染色体异常,或者染色单体异常。大多数诱导有机体突变的物质会引起染色单体异常,但是染色体异常也会发生。多倍体的增加也可以证明一种化学物质有诱发染色体数目异常的潜力。然而,这种方法不是为了测定数目异常而设计的,也不常用于此目的。染色体变异以及相关变化是很多人类遗传病的起因,并且有确实的现象证明染色体变异及其相关变化导致的体细胞中治癌基因和肿瘤抑制基因的变化与人类和动物样品的癌症反应有关。体外哺乳动物染色体异常实验要进行移植的细胞层,细胞株和初级细胞群的培养。所选用的细胞应从培养中的生长能力,染色体组型平衡能力,染色体数目,染色体多样性,和染色体异常的自发频率几方面进行挑选。在体外进行的测定通常需要借助于外加的代谢活化系统。在体外的测定条件下,不可能完全模拟出哺乳动物样品的新陈代谢系统。要小心控制条件,以避免无法表现内在诱变的阳性的结果出现,及PH值、同渗重摩、细胞内高毒素量(4)(5)的增长。这个实验是用来辨认可诱导哺乳动物内有机体突变的物质和致癌物质。哺乳动物体内的致癌物质多数在这个测定中起正反应;但是此测定并不能完全测定出体内的致癌物。联系是建立在化学物质的种类之上的。不断的事实证明,那些用此测定未被测定出的致癌物是通过机械机制作用,而不是通过直接的DNA破坏来作用的。可参看综合引言B.1.2. 定义染色单体变异:通过单个的染色单体分解和染色单体的重组表现的结构性染色体损伤。染色体变异:表现为同一位置的两条染色单体的分解,或者分解后又重组染色体结构损伤。核内复制:在DNA复制的一个S时期后,核没有进入有丝分裂,却开始另一个S时期的过程。结果是带有4,8,16,……染色单体的染色体的出现。缝隙:在一个染色单体范围内的最小程度的染色单体未对准错误。有丝分裂指数:细胞转位期在一个细胞群中被总的细胞数目所分隔开的比率;是对该细胞群的增生扩散程度的反映。数目异常:染色体数目相对于细胞正常数目的变化。染色多体:单倍染色体(n)的复制而不是双倍数染色体的复制(例如3n,4n等等);结构性异常:可由显微镜观测到的有丝分裂细胞分化过程中的染色体结构变化,能观察到碎片,及内在改变或交换。1.3.实验原理细胞株要在有代谢活化作用和无代谢活化作用下与测定物接触。在细胞株与测定物接触后的一定预定时间间隔后,用中间体捕获物质(如Colemid或秋水仙素)处理,来捕获过渡期的细胞。过渡期的细胞要在显微镜下分析其染色体异常表现。1.4. 实验步骤1.4.1. 准备1.4.1.1. 细胞可选用各种细胞列,细胞株和细胞群包括人的体细胞(如中国鼠类的纤维原细胞、人类或其他哺乳动物淋巴中的淋巴细胞)。1.4.1.2. 介质和培养条件应采用合适的培养媒介及培养条件(培养皿,CO2浓度,温度及湿度)来保存细胞群。需在染色单体数目的稳定性和是否存在支原体污染两方面对选定的细胞列和细胞株进行定期测定。如已被支原体污染,应不再选用。应该知道正常的细胞存活周期及存活条件。1.4.1.3.培养准备选定细胞列和细胞株:从普通的细胞群繁殖细胞,在培养媒介中,以一种在采样前不会产生细胞群混合的浓度和370淋巴球: 血液用抗凝结剂(如肝磷脂)进行处理,后将从建康体中分离出的淋巴球中加入含有分裂素(如植物血球凝集素)的培养基,并在37℃1.4.1.4.新陈代谢活性细胞应在存在代谢活性和不存在代谢活性的条件下与测定药物接触。最常用的活化系统是经诱导酶介质处理的,从啮齿类动物肝脏制备的cofactor-supplemented post-motochondrial fraction。所用的诱导酶介质如Aroclor1254(6)(7)(8)(9)获苯巴比酮与β萘黄酮(10)(11)(12)的混合物。在最终的测定媒介中,末段线粒体片段常被应用于浓度范围1~10%v/v之间。代谢活化系统的条件决定于被测定的化学物质。在某些情况下,可以不止一种末段线粒体浓度被选用。数目的增长,包括能表达特殊活化作用的酶的经遗传得到的功能性细胞的构造,可以提供潜在的内部活化作用。应按科学的方法调整对细胞列的选择(如根据细胞色素P450同功能酶对测定物的新陈代谢的适应度)。1.4.1.5. 测定物质/准备固体测定物质应该在合适的溶剂或媒介物中被溶解或形成悬浊液,如果高于细胞处理浓度应进行稀释。液体测定物可直接加入测定体系或稀释到高于处理浓度。测定物应是新鲜制成的,除非有确切的实验数据证明储存物的可用性。1.4.
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