第五章第一节[精选].pptVIP

1、渗透压变化法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法， 将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。 渗透压 细胞破碎 2、冻结-融化法（温度差破碎法） 将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能， 另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。 3、压力差破碎法 通过压力突然的变化，达到细胞破碎的目的。 a.高压冲击法：结实容器中装入冰晶、石英砂等。用活塞或冲击锤施以高压冲击。P=50~500MPa b.突然降压法：悬浮液装进高压容器，加压至30MPa，打开出口阀使悬液迅速流出。 要点： 压力差：3MPa以上 降压速度：速度越快越好 细胞种类和生长期：革兰氏阴性菌生长期 瞬间可达爆炸的效果 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。 三、化学法（Chemical permeation） 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。 酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。 碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。 成本低，反应激烈，不具选择性。 1、酸、碱处理法 不适用于酶工程！！ 细胞破碎常用的表面活性剂： 十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）； 非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。 2、表面活性剂 无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用， 能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解 能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 3、有机溶剂 4、EDTA螯合剂 处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。 G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。 为防止酶的变性失活，操作时应当在低温条件下进行 通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒。 化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度 化学渗透法特点： 缺点 对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 优点 对酶工程适用性较差！！！ 四、酶解（酶溶法 Enymatic lysis) 酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。 常用的酶 溶菌酶、 β-1，3-葡聚糖酶、 β-1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等 溶菌酶主要用于细菌类 酵母类 溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶， 酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。 * 有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。 Eg: 对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。 酶解法的特点 优点： 发生酶解的条件温和 能选择性地释放产物 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整 缺点： 溶酶价格高， 溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶) 产物抑制的存在。 利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构