07-基因操!作3.pptVIP

重组DNA连接、转移、筛选与鉴定 连接： 两个具有平末端的双链DNA分子连接。 问题：低效率、串珠现象； 利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3‘端各加上一段寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC),制成人工粘性末端； 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA分子。 重组DNA连接--同聚物加尾法 将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列), 加到载体或外源DNA的分子上, 然后通过酶切制造粘性末端，再进行连接的方法。 连接反应体系（20μl）： 重组DNA连接、转移、筛选与鉴定 重组 DNA 导入宿主 接合 (conjugation）：当细胞之间、细菌间通过菌毛相互接触时，质粒DNA 从一个细胞(细菌) 至另一细胞(细菌)的转移。 转导（transduction）：???当病毒（噬菌体）从被感染的(供体)细胞释放出来、再感染另一(受体)细胞时，发生DNA转移及基因重组。 转座(transposition )：有些基因可以从一个位置移动到另一位置，由可移动的DNA 序列（插入序列和转座子）介导。 基因转移过程中，不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。 包括位点特异性的重组（整合酶催化）和 同源重组两种类型。 发生在同源序列间的同源重组，又称基本重组。 同源重组依赖两分子间序列的相同或相似性，将外源DNA整合进宿主染色体。 体外重组DNA的转移 转化(transformation)：普通 DNA 的转移 转染(transfectim)：病毒核酸的转移 感染(infection)：病毒的侵染等。 热击法（氯化钙法） 能够接受转化作用的细菌的生理状态叫感受态 。 外源基因导入组织或细胞的一种物理学转化方法。 基因枪(gene gun) 微粒轰击法(microparticle bombardment)： 将载有外源基因的微米/亚微米级的金属微粒（钨或金粉）加速，高速轰击并射入受体靶细胞的方法。 电穿孔(electroporation)转化： 利用高压电脉冲的电激作用将外源基因导入细胞的转化方法。 电击仪: Gene Pulse? Ⅱ及0.2 cm 电击杯 电击参数： 电容-10μF，电阻-400Ω，电压-1.5 kV； 电击缓冲液：10% 甘油或蔗糖。 重组DNA连接、转移、筛选与鉴定 插入失活筛选（抗性基因插入失活） 蓝白斑筛选； PCR筛选； 酶切鉴定；核酸杂交等。 酶切鉴定 反应体系(20μl) ： 质粒DNA 3μl 10×M Buffer 2μl EcoR I 1μl HindIII 1μl 补灭菌超纯水至 20μl 37℃水浴中酶切1h。 反应结束取8μl 进行1%琼脂糖凝胶电泳检查酶切情况，确定插入片段大小。 选择酶切鉴定正确的克隆进一步测序，备用。 核酸杂交 分子杂交(molecular hybridization) ： 检测混合样品中特定核酸分子的存在，以及其分子量大小。 Southern 杂交、Northern 杂交 原理: 两条具有碱基互补序列的DNA分子变性后, 在溶液中一起进行复性时, 可以形成杂合双链DNA分子。 杂交的双方是待测的核苷酸序列（克隆的基因片段或基因组DNA或是细胞总RNA）及探针。 1.引起核酸变性的因素： 酸、碱、热、变性剂（尿素、胍） 有机溶剂（乙醇、丙酮） 2.核酸的复性（Renaturation）退火： 互补单链重新缔合成双链的过程。 影响复性速度的因素： DNA大小；离子强度；DNA浓度； 核酸杂交 Southern 杂交 菌落杂交 斑点杂交 Southern 杂交 Southern blotting ： 用合适的限制性内切酶消化DNA, 电泳分离DNA片段, 利用毛细作用, 使液体经过凝胶, 使DNA片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物（硝酸纤维膜）表面，然后进行杂交。 作用：检测特定基因的大小、拷贝数、变异等。 Southern 杂交 DNA的抽提、质量检测； 限制性内切酶操作； DNA的琼脂糖凝胶电泳分离、0.4N NaOH碱变性； 转膜（毛细管渗吸或电转移）； 80℃ 处理或紫外线照射将 DNA 固定在膜上； 探针制备、检测等。 能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸序列。 分类: 1. 同位素标记 2. 非同位素标记:地高辛 （digoxygenin, DIG） 标记核酸探针,利用抗 DIG 的抗体通过酶联免疫反应检测。