microRNA研究讲解.pptVIP

基因芯片技术 ? 可以高通量的检测基因表达谱，检 测灵敏度较高 ? 芯片制作和检测需要昂贵的仪器 ? 结果是半定量的，重复性较差 ? 不能同时优化所有待测miRNA的杂 交环境，因而不能区分高度类似的 miRNA Northern杂交 ? 简便可靠，将已知浓度梯度的寡核苷酸参照物与待测样品进行平行杂 交，实现对miRNA的半定量检测 ? 既可用于检测miRNA在组织细胞中的表达水平，又可结合RNA marker 检测miRNA的分子大小 ? 缺点：对样品的需求量较高，需要微克级样品才能避免假阴性，有时 样品量达到40ug才会出现明显杂交信号 原位杂交技术 ? 可检测miRNA表达，并直观的展示出miRNA的时空表达模式 ? 可在福尔马林固定的组织、石蜡包埋组织、细胞及亚细胞水平 进行miRNA的检测 ? 既可以检测不同细胞系单个细胞中的miRNA表达，又可在不经分 类和分离的情况下，比较不同细胞系中miRNA的表达水平 RT-PCR技术 ? 简洁、快速、特异的检测miRNA的相对含量 ? 高通量，可同时检测多种miRNA的表达 ? 仅需少量RNA，且不用放射性同位素标记 ? 可同时检测到成熟miRNA及其对应的pre-miRNA ? 需确保引物3’端的不同，较高的退火温度（60－61℃）可提高反应特 异性，以富集的miRNA为模板扩增可提高检测的灵敏性 荧光定量技术 ? 高度特异性 ? 超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度 ? 样品消耗少，仅需1～10ng的总RNA ? 适用范围广，总RNA、细胞裂解物及纯化的RNA都可 用于miRNA的定量检测 ? 引物、探针设计要求较高 * miRNA研究现状及技术路线 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD. ? ? ? 内容概要 miRNA简介 miRNA研究的应用领域 miRNA研究的技术路线 miRNA研究背景 ? 1993年，在线虫中克隆了lin-4基因，并通过定点突变发现lin-4并不 编码蛋白，而是产生一种小RNA分子。 ? 2001年德国，英国，美国三个实验室运用生物信息学和分子生物学手 段发现大量的miRNA. ? 2002年，Science杂志将“Small RNA RNAi”评为2002年度最耀眼的 明星。同时，Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成果之一。 ? 2005年，microRNA的研究第五次入选“十大科技突破”。 ? 。。。。。。。。 miRNA定义 (MicroRNAs，miRNAs)是一种广泛存在于真核 生物中的单链小分子RNA，不具有编码功能，定位于 RNA前体的3’端或者5’端。 miRNA的生物学特征 ? 19-25nt的单链小分子，存在于真核生物中，非编码序列，没有ORF， 在3’端有1～2个碱基的长度变化 ? 能够互补配对结合于基因序列的侧翼区域，阻遏或抑制靶mRNA的翻译 ? 由核酸酶Dicer作用于前体的双链而生成的产物含有3’羟基和5’磷酸 的核苷酸片段，这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片 段区别开来 ? 大多数miRNA基因以基因簇形式存在于基因组中，它们多以顺反子的 形式转录出前体转录本，且大部分位于独立的转录单位中 ? miRNA在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性。 miRNA的产生与功能 1.在细胞核内转录成前体转录本 2.被RNaseⅢ核酸酶Drosha加工成约 70-90nt的发夹状pre-miRNA 3.转运到细胞质被Dicer加工成成 熟的miRNA 4.双链miRNA分子被解链，单链的miRNA 进入一个核糖蛋白复合体miRNP(RISC) 5.通过与靶基因的3‘UTR区互补配对，指 导miRNP复合体对靶基因mRNA 进行切割 或者翻译抑制。 miRNA的作用机制 miRNA的调控特点 ? 交叉调节：动物miRNA与靶mRNA之间的不完全配对使得任何一个miRNA 都可能作用于不同的mRNA，一个mRNA也可能受到多个不同miRNA的调节。 ? 自我调节：自我调节参与了miRNA 的生物合成和功能。例如, 参与 miRNA生物合成的一些酶也受到其产物miRNA的调节。Dcl1 mRNA编码 一种植物Dicer蛋白参与miRNA的生成, 同时它也是miR2162的靶分子。 ? 可逆性调节：miRNA所致的翻译抑制在某些条件下是可逆的。当mRNA作 为miRNA抑制的靶分子后, mRNA 会被送至胞浆内的P 体( Pbodies) 重 新定位。 miRNA调节方式的优点 ? 与蛋白水平的调节相比，更加节省能量 ? 与转录水平调节相比，miRNA调节更迅速，而且是可逆的 ? 内含子所编码的miRNA是一种对基因