植物的口原生质体培养.pptVIP

第五章 植物的原生质体培养 主要内容 ?原生质体的概念 ?原生质体培养的优越性 ?原生质体的分离 ?原生质体的培养 原生质体(protoplast)： 指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露球形细胞。 一、植物原生质体的特点： 1、吸收能力增强：易于摄取外来遗传物质、细胞器、细菌、病毒等；易于吸收氧、养分； 2、具有全能性：具有全套的遗传物质，具有细胞壁再生并能进行人工培养分化发育成完整植株的能力； ?3、在一定条件下可诱导原生质体融合，形成杂种细胞 。 4、分泌能力提高 去除了细胞壁的扩散障碍，使细胞膜的透过性增强，利于胞内产物的分泌。 5、稳定性较差 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易于受到渗透压等条件变化的影响。 原生质体用途 二、 原生质体的制备 不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不一样。 1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛的细胞。 ?无菌试管苗叶片 ?上胚轴和子叶 ?培养细胞（愈伤组织） 2、原生质体的分离 1）、机械法 2）、酶解法 1）、机械法 ? 1892年首先用于藻类分离原生质体 ? 做法：先使细胞质壁分离，再用刀把细胞壁切破，使原生质体流出或释放出来。 ? 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。 ? 缺点： 1) 手工操作难度大，原生质体得率低，费时费力，难以大量制备。 2）能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。 2）、酶解法 ? 1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番茄幼苗根尖中大量制备出原生质体； ? 常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗牛酶等； ? 优点：条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。 ? 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的活力。 ?酶解制备原生质体过程 ? 1)、取材消毒 ? 2)、酶解制备 ? 3)、原生质体收集 A、酶溶剂及其渗透压 ?酶的种类、 ?酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制、PH値。 ?渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 B、酶解时间：酶浓度及温度 3、原生质体的收集和纯化： ? 1）沉淀法： 筛网过滤除去未消化的细胞、细胞团和碎片后在适当试剂内低速离心。 优缺点： ? 比较简单 ? 但不易除尽一些完整的细胞，或引起原生质的破碎 ? 2）飘浮法： 据原生质体比重小能在一定渗透压的溶液（如25%的蔗糖）中漂浮得到收集。 优缺点： 可以得到较为纯净、完整的原生质体， 但完好的原生质体数量较少 ? 3）沉淀法和飘浮法结合： 先沉淀后漂浮，重复操作，纯化后可用于培养或细胞融合。 ? 4）界面法 采用两种比重不同的溶液，使原生质体 处于两液相的界面之中 优缺点： 可以收到数量较大的纯净原生质体，同 时避免收集过程中原生质体因相互挤压而 破碎 ?目的：检验获得的原生质体是否真正的原生质体 ?鉴定方法(针对有无细胞壁)： 5、原生质体活力检测 ?染色法 ? FDA法：FDA（二乙酸荧光素）能穿越细胞质膜，被活细胞内的酯酶裂解，在荧光显微镜下发荧光（荧光素）。 ?伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，但质膜受到严重损坏使细胞被染色。 ?胞质环流法：是否存在胞质环流判断原生 质体活力； ?渗透压变化法：活原生质体会随着外界渗透压的变化体积变化 ?氧电极法：活原生质体在光照下光合放氧，无光呼吸耗氧 例子: 植物（烟草）叶肉细胞原生质体的分离 ?1). 材料的准备与消毒： ? 2). 酶解： ? 3). 纯化： ? 4). 原生质体的活力测定 1). 材料的准备与消毒 选取在温室中生长两个月左右的烟草植株 从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片 经自来水冲洗干净后 放入70%乙醇中进行表面消毒 然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟 接着用无菌水洗涤3~4次，以充分除去消毒剂 2). 酶解 ? 用一把尖镊子，小心撕去叶片的下表皮，将叶片切