第2章 基因工程制药（二）幻灯片.pptVIP

第二章 第十三节 基因工程药物的制造实例 一、干扰素 干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素再分为α1b、α2a、α2b等亚型，其区别表现为个别氨基酸的差异。 早期干扰素是用病毒诱导人白血球产生的，产量低、价格昂贵，不能满足需要。 现在可以利用基因工程技术在大肠杆菌中表达、发酵来生产干扰素。 1.基因工程菌的组建 组建过程：分离干扰素mRNA，以mRNA为模板反转录合成cDNA，将cDNA克隆到载体中并转化大肠杆菌K12，获得干扰素基因工程菌。 所克隆的干扰素cDNA是从抗病毒活性最高的12SmRNA区域合成的。 克隆载体pBR322质粒，含有四环素和氨苄青霉素抗性基因。 pBR322质粒结构图 重组人干扰素产品 组建干扰素工程菌的流程 诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱获得mRNA 5%～23%蔗糖密度梯度离心提取12S的mRNA 自mRNA反转录成cDNA 双链cDNA用末端DNA转移酶接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒DNA的PstⅠ酶切割加上dA或dC 退火获得杂交质粒 转化大肠杆菌K12 扩增杂交质粒 筛选抗四环素但对氨苄青霉素敏感的细菌克隆 用已知干扰素的DNA片段作为探针挑选富有干扰素cDNA的克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达 2. 基因工程干扰素的制备 制备基因工程α-干扰素工艺流程如下： 启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 半成品检定 半成品制备 精提 分装 冻干 成品检定 成品包装 α2b干扰素生产过程 1.发酵 工程菌：SW-IFNα-2b/E.coli DH5α，质粒用PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。 培养基含1%蛋白冻、0.5%酵母提取物、0.5% NaCl。 接种后摇床培养30℃，10h，发酵种子。 15L发酵罐培养，30℃，转速500r/min，8h。然后42℃下诱导，2～3h。离心去上清。 2.产品的提取与纯化 4000r/min离心30min，去上清后，湿菌超声破碎，离心，取沉淀部分用溶解缓冲液进行处理，上清超滤浓缩，Sephadex G-50 分离。 经SDS检查。 再经DE-52柱纯化。 3. 质量控制标准和要求 3.1 半成品检定 ⑴干扰素效价测定 ⑵蛋白质含量测定 ⑶比活性 ⑷纯度测定 ⑸相对分子量测定 ⑹残余外源性DNA含量测定 ⑺残余血清igG含量测定 ⑻残余抗生素活性测定 ⑼紫外光谱扫描 ⑽肽图测定 ⑾等电点测定 ⑿除菌半成品干扰素效价测定、无菌试验、热原试验。 3.2 成品检定 ⑴物理性状 ⑵鉴别试验 ⑶水分测定 ⑷无菌试验 ⑸热原试验 ⑹干扰素效价测定 ⑺安全试验 二、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GMCSF）是一个具有多项潜能的造血生长因子，它不仅能够促进造血前体细胞的增殖、分化和成熟，而且对其它的细胞，如抗原递呈细胞、成纤维细胞、角质细胞、皮肤粘膜细胞等，均有着不同程度的刺激作用。 GMCSF对某些疾病，如肿瘤患者放疗、化疗以后的白细胞减少症、再生障碍性贫血和骨髓移植的治疗有重要作用，以及在抗病素、抗真菌感染等的治疗中也有良好的疗效。 1985年Sieff等发表了第一篇有关重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的文章后，这些年来有关rhGMCSF研究报道的文献每年均在千篇左右。 GMCSF是糖蛋白，相对分子质量为22000，基因定位在第5条染色体长臂上，基因约2.5kb，含有4个外显子和3个内含子。其mRNA包括编码成熟蛋白质的127个氨基酸残基和信号肽的17个氨基酸残基的密码子。 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子产品 1. 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的制备 利用表达分泌型GMCSF工程菌W3100/ pGMCSF可以表达具有天然结构和生物活性的GMCSF，表达量高，易于纯化，无需复性，纯化的GMCSF比活高于包含体型，但其发酵表达技术较难掌握。 分泌型GMCSF工菌型W3100/pGMCSF发酵工艺 发酵 甘油保存菌划平皿，