组织培养实验教案要点.doc

实验一 组培实验室常用洗涤灭菌方法 一、实验目的和要求：植物组织培养是一项十分细致的工作，为了保证植物外植体不受污染，第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒，使它们保持无菌状态，做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧，因此每个学生必须学好这套基本功。在进行各类具体的组培实验前，首先了解组培室的结构及主要设备的用途和性能是十分必要的，总体上的了解有利于以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。过氧化氢、高锰酸钾、漂白粉、次氯酸钠、酒精 MS培养基的制备及高压灭菌 一、实验目的和要求：通过实验使学生认识掌握配置与保存培养基的基本技能。 二、仪器设备：天平、烧杯、容量瓶、量筒、冰箱、电炉、高压蒸汽灭举锅、移液管、培养瓶、标签。 三、试剂：待配各种培养基的组成成分、琼脂、蔗糖 四、实验步骤： 1.母液的称取 2.生长调节剂的量取 3.固化剂的称取 4.蔗糖的称取 5.定容 6.调pH 7.分装 8.灭菌 培养基母液的配制和保存 MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。大量元素(母液) mg／LNH4NO3 33000 KNO3 38000 CaCl2·2H2O 8800 MgSO4·7H2O 7400 KH2PO4 3400 微量元素(母液) KI 166 H3BO3 1240 MnSO4·4H2O 4460 ZnSO4·7H2O 1720 Na2MoO4·2H2O 50 CuSO4·5H2O 5 CoCl2·6H2O 5 铁盐(母液) FeSO4·7H2O 5560 Na2-EDTA·2H2O 7460 有机成分(母液) ⅣA 肌醇 20000 ⅣB 烟酸 100 盐酸吡哆醇(维生素B6) 100 盐酸硫胺素(维生素B1) 100 甘氨酸 400 以上各种营养成分的用量，除了母液为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。其中，母液、母液及母液的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。母液的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至55，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(01 mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为01 mg/mL的母液。配制培养液 用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液为50 mL，母液、、A和B各5 mL。再取2，4D 5 mL、NAA 1 mL，与各种母液一起放入烧杯中。配制培养液时应注意：在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(54～70)测培养基的pH，