G418 转染实例.docVIP

一、 试剂准备 1、 HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90mlddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml,pH7.4，滤过除菌。 2、核酸贮存液，过滤除菌。 3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。 二、操作步骤（一）克隆目的基因1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。 2、回收特异性扩增片段，连入T载体。 3、转化DH5α，质粒制备。 4、酶切初步鉴定，测序证实。 （二） 真核重组表达载体的构建： pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。 重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切 回收插入片段和pcDNA3线性片段 T4连接酶连接 转化DH5α 质粒制备 BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。（三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞：1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结