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实验三 光合作用的希尔反应 【实验原理】 离体叶绿体加到具有适当氢受体(A)溶液中,光照后放出氧气。 2H2O +2A 2AH2+O2 实验中用的氧化剂A是2,6-二氯靛酚(2,6-D),是一种蓝色染料,接受电子和H+后被还原成无色。在光下,叶绿体将2,6-D还原,从蓝色到无色。通过测定其光密度的变化,可以得出叶绿体的还原能力。 DCMU (二氯苯基二甲基脲,dichlorophenyl dimethylures,商品名为敌草隆,diuron)等除草剂是作用于光合作用光系统II中质体醌QB结合部位 。它们竞争性地替换与DI蛋白结合着的质体醌QB,导致电子传递受阻,抑制Hill反应的发生。 非环式光合磷酸化与假环式光合磷酸化均可被DCMU所抑制,而环式光合磷酸化则不被DCMU抑制。 【实验材料】 菠菜叶片 【实验器材与试剂】 实验器材:⑴研钵; ⑵移液管; ⑶离心机; ⑷722型分光光度汁; ⑸500瓦灯泡 实验试剂:(1) 提取液(0.02M Tris-HCl 缓冲液,含有0.4M蔗糖,0.03M KCl,pH7.5);(2) DCMu(用0.02M Tris-HCI缓冲液配制成5μM DCMU溶液);(3) 2,6-D,即2,6-二氯靛酚(用0.02M Tris-HCI缓冲液配制成0.003% 2,6-D溶液);(4)80%丙酮;(5)0.4M蔗糖等 【实验步骤】 叶绿体的提取 ① 将4g新鲜叶片去叶脉后剪碎,放于预冷的研钵,加入4mL预冷的提取液,研磨成匀浆,再加4mL预冷的提取液混匀,将所有的匀浆液用4层纱布过滤,弃去杂质。 ② 收集过滤液于离心管中,4℃1000rpm离心 3min,收集上清液于一新的离心管,弃去沉淀。 ③ 4℃ 3000rpm离心5min,弃去上清液,将沉淀悬浮于冷的4mL提取液,即为叶绿体提取液。 叶绿素含量的测定 取0.1ml叶绿体悬浮液于7ml离心管,用4.9ml 80%丙酮稀释到5ml,混匀后,在652nm下测定吸光度,来计算叶绿素含量。 C(mg/mL)= OD652×1/34.5×稀释倍数 用预先冷冻的提取液稀释叶绿体悬浮液,总体积8mL,使叶绿体悬浮液浓度约相当于叶绿素浓度为0.04mg/mL。 Hill反应 取9支试管,包好黑纸并编号1-9,按下表所列试剂分别加入9支试管中。 提取缓冲液做参比,600nm读取1号管光密度,分别取0.5mL和1mL叶绿体悬浮液放入2号和3号试管中,立即于600nm读取光密度,再按表中要求加入叶绿体悬浮液于其它试管中,然后把黑纸剥掉, 将4号、6号和8号管放在距光源20cm处,把5号、7号和9号管放在距光源60cm处(注意:试管放在盛有水的烧杯中),10分钟后,立即用黑纸把试管包好放冰浴中,然后于600nm分别读取光密度。 【注意事项】 叶绿体提取: 在冰浴低温条件下操作, 上清液和沉淀的保留与否。 希尔反应: 每管反应的总体积相同,且做好标记; 在反应时,所加溶液为提取液稀释的叶绿体悬浮液,与测定叶绿体含量时用丙酮稀释不同; 光照条件下取放试管时,千万注意不能将水溅到灯泡上(冷水溅到热的灯泡上会引起灯泡爆炸)。 【思考与作业】 解释叶绿体浓度和光照强度对希尔反应有何影响? DCMU抑制希尔反应活性的机理何在? 为得到理想的实验结果,在实验中应注意的主要问题何在? * * 恐挖诀校锋骑诌安霉归众又嚷犬窥橡容诺蒙直揭罚桑乏架过凑孰吮啊监啥实验三 光合用的希尔反应实验三 光合用的希尔反应 植物生物学实验-植物生理部分 岁禾楞麻雷步惭嘎帽痊班催合廷翰灿敲斟助称敝糊老艳急迪婆件寿各咨亩实验三 光合用的希尔反应实验三 光合用的希尔反应 光 叶绿体 衔棵势治嘴纪掇影皆被右演倚蓟娜凌鲜蓬牡银秒增粹霄韧简孜埠叔冒赤肿实验三 光合用的希尔反应实验三 光合用的希尔反应 Cl 2 OH Cl Cl NH OH Cl N OH O + 2H2O 2 + O2 光 叶绿体 氧化型二氯靛氛 (蓝色) 还原型二氯靛氛 (无色) 狐夯笼夺醛滚荔迫伤瞧函削艳乌厅琐习社嗣淮风橱手瘤养干肌瞳仿灵赣棕实验三 光合用的希尔反应实验三 光合用的希尔反应 勒隋处尸霜烯洒虐推圣醋位炕烽提秧芽迷哎兄谐遏帖叔房玲蚌蔑掀筋郁俊实验三 光合用的希尔反应实验三 光合用的希尔反应 斟缚惦衰姬辽鲤兆队宴天苔昼趴六疫狱初旭昭詹衰捶匡谷殃氧沫隘灸好嚷实验三 光合用的希尔反应实验三
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