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广谱抑菌乳酸菌素的纯化及其功能基因的克隆表达研究 乳酸菌的分离、筛选及生理生化检测 1.菌种的分离 1.1样品的处理 配置250m无菌水，在操作台中将样品放置锥形瓶中。37℃摇床1小时。 1.2培养基 乳酸菌分离培养：MRS、Elliker、BS、LSA、CQ 培养基。以上培养基均在 121℃灭菌15min。 1.3菌株的分离 采用稀释平板涂布法对奶酪中的菌群进行分离，将样品用灭菌水做 10 倍梯度 的稀释，吸取10-1，10-2，10-3三个稀释度，取悬液0. 2 mL 分别涂布于5种固体平板上， 每个梯度稀释液涂布4个平板， 分 2 组置于有氧和厌氧条件下， 37℃培养1-2d， 转接划线培养2次将保存的菌种放至35℃冰箱恒温箱中培养，待菌落外形无较大变化进行液体富集。在无菌操作台上挑取特征明显，生长旺盛的菌落接种至以灭过菌的15mlMRS液体培养基试管中，37℃，培养24h。观察菌液浑浊取出，在无菌工作台上，取培养好的菌液于1.5mlEP管中以备提取DNA，另取菌液进行镜检。 1.4革兰氏染色 将已分离出的600株乳酸菌进行革兰氏染色初步确定为乳酸菌 洗片→少许菌苔→晾干→结晶紫初染1min→水洗→晾干→碘液媒染30s→水洗→晾干→95%酒精脱色20s→水洗→晾干→番红复染→水洗→晾干→镜检。 1.5菌种保藏 对于镜检后的菌株进行甘油冷冻保藏。分别从液体培养的试管中取0.7ml菌液与0.5ml甘油混合在菌种保藏管中，摇匀后先放置在4℃冰箱中预冷24h。隔天将菌种放置-80℃冰箱中冷藏。 1.6提取菌株DNA (1)将装有菌液的EP管置于置于离心机中12000r/min，离心5min，弃掉上清液； (2)加入0.2mlTE缓冲液稍微震荡一下，加入0.05ml溶菌酶L，微震荡，在水浴锅中加热10min，温度55℃； （3）取出后，先加入0.05ml蛋白酶K，再加入0.3mlSDS，放置55℃水浴锅中加热15min； （4）取出后，加入5molNaCl0.1ml。0.08mlCTAB，混匀，放置65℃水浴10min； （5）取出后加入0.25ml苯酚，0.25ml异戊醇混合液，12000r/min离心5min。取上清液，继续加入0.25ml苯酚，0.25ml异戊醇进行抽提，离心5min，重复2次； （6）取离心好后的上清液置于新EP管中，加入0.02ml醋酸钠后，加入与上清液等体积的无水乙醇0.2ml。放置4℃冰箱过夜； （7）去过夜的EP管进行离心5min，将离心管中的液体全部缓慢倒掉，继续加入0.5ml70%乙醇，离心5min，取出后继续倒掉液体，再加入0.5ml70%乙醇离心5min。将EP管晾干至无乙醇味，加入0.1mlTE缓冲液。放置-20℃冰箱保存。用于PCR扩增。 1.716S rRNA 基因 PCR 扩增和系统进化分析 应用细菌16SrRNA通用引物（正向引物271:5’-GAGAGTTTGATCCTGGGTGAG-3’，反向引物1492r：5’CTACGGTACCTTGTTACGGA-3’）进行PCR扩增。 PCR配方(25μl体系) 2μl 200μM DNTP 0.5μl Primer 2.5μl buffer(50μM KCI，100μM Tris一HCI，调PH至8.3) 0.5μl Taq酶 lμl 模板 18μl 双蒸消毒水 PCR条件:扩增过程包括:95℃下变性4min，95℃下变性30s，51℃退火 30s，72℃延伸lmin，循环35次，72℃延伸10mnin，最后4℃。30个循环。 PCR 产物纯化后，由上海生工生物科技有限公司采用用正向扩增引物直接测序。将测序结果提交到 GenBank数据库中，序列同源性分析利用BLAST在线进行。从数据库获得相关属、相关种的 16S rRNA 基因序列，建立系统发育树。 1.8 rep-PCR 指纹图谱分析（可以鉴定到种水平） 指纹图谱所采用的引物所使用的引物为：BOX-AIR：5’ -CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3’。 PCR扩增程序95 ℃变性30 s，40 ℃退火1min，72 ℃延 伸 2 min，35个循环，最终退火温度为72℃，5min。PCR产物经1.5%的琼脂糖分离，60V电压电泳5-6 h。所得的电泳图谱以TIFF格式保存，然后采用凝胶分析软件对rep-PCR指纹图谱进行分析。 1.9乳酸菌生理生化鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》进行几种主要鉴定： 大分子物质的水解试验: 1.淀粉水解试验 无菌操作将活化好的菌种接种到灭好菌的淀粉培养基中，另做一个不接种的 平板做空白对照；将平皿密封倒置于37e恒温培养箱中培养24h；观察细菌的生 长情况，将平皿