第六章抗体工程制药课件.pptVIP

抗体的发现 德国学者Behring和日本学者北里于1890年在Koch研究所应用白喉外毒素给动物免疫，发现在其血清中有一种能中和外毒素的物质，称为抗毒素。 将这种免疫血清转移给正常动物也有中和外毒素的作用。这种被动免疫法很快应用于临床治疗。 Behring于1891年应用来自动物的免疫血清成功地治疗了一个白喉患者，这是第一个被动免疫治疗的病例。 诺贝尔奖得主：德国科学家贝林 德国的细菌学家埃米尔·冯·贝林(Emil von Behring 1854-1917) 。1901年因其研究抗毒素血清，尤其在运用血清治疗防治白喉和破伤风等病症方面的贡献被授予诺贝尔医学奖。 免疫球蛋白的基本结构 重链（heavy chain，H） 由450～550个氨基酸残基组成，分子量50～75 kDa根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，其重链分别为：γ、α、μ、δ、ε 免疫球蛋白的基本结构 轻链（light chain，L） 由214个氨基酸残基构成，分子量约25 kDa 轻链有? 链和? 链两种，一个天然Ig分子上两条轻链的型别总是相同的，但同一个体内可存在分别带有? 链和? 链的抗体分子，其比例具有种属特异性 可变区（variable region，V区） 轻链和重链中靠近N-端氨基酸序列变化较大的区域 重链和轻链的V区分别称为VH和VL 分别占重链和轻链的1/4和1/2 VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变，称为高变区（HVR）或互补决定区（CDR），共同组成Ig的抗原结合部位 在V区中CDR之外的区域氨基酸组成和序列相对不变，称为骨架区（FR） 恒定区（constant region，C区） 靠近C-端氨基酸序列相对稳定的区域 重链和轻链的C区分别称为CH和CL 分别占重链和轻链的3/4和1/2 不同型Ig的CL长度基本一致，但不同类Ig CH的长度不一 Ig的结构域 两条重链和轻链均可折叠成数个球形结构域，每个结构域约由110个氨基酸残基构成 二级结构由反向平行的两个?-片层（?-sheet）组成，两个?-片中心的两个Cys由一个链内二硫键垂直连接，形成“?-桶状（?-barrel）”结构，这种折叠方式称为“免疫球蛋白折叠（immuno- globulin folding）” 铰链区（hinge region） 位于CH1与CH2之间 含有丰富的Pro 易伸展、弯曲，能改变两个结合抗原的Y形臂之间的距离，有利于两臂同时结合两个不同的抗原表位 易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，产生不同的水解片段 （2）单克隆抗体 McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。 1975年，K?hler and Milstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出 McAb. 在临床上主要用于诊断和治疗。 木瓜蛋白酶水解片段 水解部位是Ig铰链区二硫键连接的两条重链在近N-端，可将Ig裂解为两个完全相同的Fab片段和一个Fc片段 Fab片段即抗原结合片段（fragment antigen binding），由一条完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成，为单价抗体片段，可与抗体结合，但不凝集 Fc片段即可结晶片段（fragment cry-stallizable），相当于IgG的CH2和CH3结构域，无抗原结合活性，是Ig与效应分子或细胞相互作用的部位 胃蛋白酶水解片段 作用于铰链区二硫键所连接的两条重链的近C-端，水解后可获得一个F(ab)2片段和一些小片段pFc F(ab)2片段由两个Fab及铰链区组成，是双价抗体片段，可同时结合两个抗原表位，可发生凝集反应和沉淀反应 F(ab)2片段保留了结合相应抗原的生物学活性，又避免了Fc片段免疫原性可能引起的副作用，广泛用作生物制品 （3）基因工程抗体 利用基因工程方法对鼠源全抗体的基因进行重组缺失修饰改型等，在原核微生物昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达，获得抗体。 包括鼠源抗体的人源化，人鼠嵌合抗体，改型抗体，小分子抗体和完全人源抗体。 杂交瘤细胞的制备 —— 骨髓瘤细胞的选择 在杂交瘤细胞技术中，主要使用多发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞，这种细胞是由抗体合成细胞克隆衰变而成的肿瘤细胞 尽可能选择自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段的骨髓瘤细胞作为亲本细胞 细胞必须处于良好的生长状态，对数生长期最好 融合时，活细胞数应至少大于90% 常用骨髓瘤细胞系 杂交瘤细胞的制备 —— 免疫脾细胞悬液的制备 取经免疫的小鼠，摘除眼球放血，将小鼠处死，无菌摘取脾脏，研磨