微生物的遗传育种-诱变育种解析.pptVIP

项目二 微生物的遗传变异和育种( Microbial genetics and breeding ) 任务三 诱变育种 ⑵出发菌株的纯化 2.菌悬液 (单孢子或单细胞悬液)的制备 常用化学诱变剂 ⑵诱变处理方法 四、营养缺陷型菌株的诱变和筛选 2.营养缺陷型的诱变 用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍，紫外线、亚硝酸等。其中亚硝基胍诱发频率极高，一般可达10％。 ⑴抗生素法 氨基酸合成代谢的人工控制赖氨酸高产菌 谢 谢！ 当然，有的真菌孢子对诱变剂比较敏感，不一定都要培养萌芽，可以直接用斜面孢子诱变处理。 离心洗涤，加入生理盐水或缓冲液，振荡打碎孢子团块，以脱脂棉或G3 - G5玻璃过滤器过滤，用血球计数法进行孢子计数，调整菌体浓度，供诱变处理。 取灭菌后的盖玻片或玻璃纸，贴于营养平板上，其上滴上数滴培养基，接上菌丝，培养后菌丝生长延伸到盖片以外的培养基上，揭去盖片，使盖片周围部分尖端菌丝断裂而留在营养平板上，然后对这些菌丝进行诱变处理。 通过自然分离，平板上选择数个单菌落，利用紫外线对菌落四周延伸的菌丝尖端进行照射或加入杀菌率低的化学诱变剂处理。培养一定时间，经过繁殖使突变的遗传性状统一、稳定，挑取顶部尖端一小段菌丝于斜面，培养后进一步摇瓶筛选。 用玻璃匀浆、过滤，取小段菌丝的菌悬液进行处理 一般认为单因子不如复合因子处理效果好。 但当一种诱变剂对某个菌株确实是有效的诱变因子，那么单因子处理同样能够引起基因突变，效果也不错。 具体做法有：①将诱变剂加入培养基倒平板；②将诱变剂涂抹在平板表面；③摇瓶振荡培养中加入诱变剂。 紫外：被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。 a．两个以上因子同时处理 即不同的诱变剂同时处理菌体，诱发其突变。 b．不同诱变剂交替处理 通常以化学因子和物理因子交替进行效果较好。交替处理时，诱变剂量宜适中或偏低。 *采用多种不同机制的诱变剂交替使用，可以动摇多种基因的稳定性，造成各种基因功能重新调整而产生丰富多彩的突变类型，提高变异率。 c. 同一种诱变剂连续重复使用 经过一种诱变剂处理后的菌悬液，培养数小时之后(细菌或酵母)，使细胞分裂1-2代，接着再处理，有时还可反复多次，最后进行分离筛选。 某些诱变能力强的、对基因作用较为广谱的诱变剂可连续重复使用，有益于变异率的提高。 但是单因子连续使用的代数不能过多，否则也会出现“钝化”现象。因为它作用于基因上的位点是有限的，有的甚至只作用于单一位置，造成突变类型少的弊病。 d．紫外线光复活交替处理 经紫外线照射后的菌体或菌悬液，暴露在日光中一定时间，接着用剂量更大的紫外线继续照射，然后再让其光照复活，经多次紫外线照射和光照复活交替，可以增加变异率，提高变异幅度。 复合因子处理中，为了提高诱变效果，具体使用时，要注意诱变剂的协同效应。 先用弱诱变因子，后用强诱变因子处理往往具有协同效应，反之，则使变异率下降，处理之前要根据不同菌种做预备试验或参考前人的经验来决定。 先对出发菌株进行诱变处理，然后涂平板分离突变株。 先处理、再分离培养；边培养边处理 诱变育种的具体操作环节很多，且常因工作目的、育种对象和操作者的安排而有所不同，但其中最基本的环节却是雷同的。以产量变异为例： 育种的策略与方法的优劣，常用优良菌种选育的时间长短加以评估 在通过各种手段改变菌体的遗传性状之后，如何将具有所需特性的菌种从数量庞大的群体中筛选出来，常是育种上至关重要也是最耗时费力的工作。 筛选的条件决定选育的方向。是决定某菌种去留的“筛子”。 这是传统选育中常用的方法，将随机挑选的菌落直接接入摇瓶培养，产物用常规法测定。 初筛以多为主，复筛以精为主。 预筛 约挑选200株 琼脂块法，产抑菌酶的菌的抑菌圈法：常用于抗生素产生菌的分离筛选。 产抑菌酶的菌的抑菌圈法：常用于抗生素产生菌的分离筛选。工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。 菌落形态变化方面还有这样的趋向：原来具有较高发酵水平的菌种作为出发菌株时，由突变引起形态剧烈变化的菌落是一些代谢严重失调的菌株，常常负变菌株占多数，而突变的高产菌株其菌落形态往往处在常态的正常范围内，因为它们的遗传物质仅受到微小损伤，还保留了正常代谢的基本功能。 冷敏菌可根据菌种选育目的进行选择，可选用那些对抗生素产生耐药性的微生物，