分子生物常规实验方法.docVIP

实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化 【实验目的】 熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。 【实验原理】 当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。此时，若在感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。 【器材与试剂】 1．实验仪器 培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯 2．实验试剂 氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g， 800 mL蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min； LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g， 800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用 3.实验材料 E.coli DH5α, pUC18质粒 【实验步骤】 1．接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡（约250r/min）培养过夜。 2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37℃继续振荡培养至OD600 3．取1 mL培养物于一灭菌的Eppendorf 管中，冰浴放置10～30 min，4℃，1 500×g离心5 min，弃上清。 4．沉淀用0.2 mL冰冷氯化钙溶液轻轻悬浮，冰浴放置15 min，4℃，1 500×g离心5 min，弃上清。 5．沉淀再用0.2 mL氯化钙溶液轻轻悬浮，放置在冰浴中，制成大肠杆菌感受态细胞。 6. 取5 μL pUC18质粒(不超过10 ng)，加入制好的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min。 7. 42 ℃ 8. 加入800 μL培养基，37 ℃ 9. 取200 μL涂布于含氨苄青霉素钠 (100 μg/mL)的LB固体培养基上, 正向放入37℃培养箱中培养1 h，再倒置培养过夜至菌落清晰，统计菌落数量。 【注意事项】 应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞，OD600最好不超过0.4。 整个实验最好在低温环境下进行，以获得较高的转化效率。 每次悬浮沉淀细胞要轻缓，避免剧烈振荡。 【实验作业】 根据质粒的用量，计算本实验制备感受态的转化率（cfu/μg DNA）。 ,,, 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 287~289 刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 22~25 Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1972,69:2110 4. 魏群.分子生物学实验指导.北京：高等教育出版社，1999.53～55 实验二 质粒的提取与琼脂糖凝胶电泳分析 【实验目的】 熟悉碱法提取质粒以及DNA的琼脂糖电泳分析的原理和方法。 【实验原理】 在碱性条件下，染色体DNA发生变性，共价闭合的质粒DNA仍为自然状态。当溶液调至中性且有高浓度的盐存在条件下，变性的染色体DNA交联成不溶性的网格结构，变性的染色体DNA与蛋白质发生共沉淀，而质粒DNA仍存在于上清液中，通过离心去除沉淀，溶液中的质粒DNA可被异丙醇沉淀。 DNA在碱性的电泳缓冲溶