生物化学实验总.docVIP

《生物化学》实验总摘 实验一 蛋白质的沉淀反应 2 实验二 考马斯亮蓝G-250比色法测蛋白质含量 4 实验三 3,5-二硝基水杨酸比色法测糖含量 6 实验四 淀粉酶活力测定及专一性实验 8 实验五 RNA提取与颜色反应 10 实验六 脂肪碘价的测定 13 实验七 脂肪酸价的测定 15 实验八 碘量法测维生素C含量 16 实验九 醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白质 18 实验十 纸层析研究植物转氨基作用 22 一、目的和要求 通过实验加深对蛋白质溶液的溶胶特性及其稳定因素的认识。 了解各种沉淀试剂使蛋白质沉淀的实质和区分可逆的盐析沉淀及不可逆的沉淀作用。 二、原理 在水溶液中，蛋白质分子表面结合大量的水分子，形成水化膜，同时蛋白质分子本身带有电荷，与溶液的反离子作用，形成双电层，因而每个蛋白质分子可形成一个稳定的胶粒。整个蛋白质溶液就形成稳定的亲水溶胶体系。与其它溶胶相同，这种稳定性是有条件的，相对的。当某些物理化学因素导致蛋白质分子失去水化膜或失去电荷，甚至变性时，它就丧失了稳定因素，以固态形式从溶液中析出，这就是蛋白质的沉淀作用。根据沉淀作用的结果，可将蛋白质的沉淀作用分为两类： 1.可逆沉淀作用：在发生沉淀作用时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的结构和性质。如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解在原来的溶剂中。因此，这种沉淀作用称为可逆沉淀作用。属于此类的有盐析作用，低温下丙酮、乙醇使蛋白质沉淀的作用，以及利用等电点的沉淀。 盐析作用：用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下，蛋白质水分子的水化膜被剥夺。同时蛋白质分子所带的电荷被中和，因而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出，但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就重新溶解。 有机溶剂沉淀蛋白质：在低温下，在蛋白质溶液中加入适量丙酮或乙醇，蛋白质分子的水化膜被破坏而沉淀。若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。 2.不可逆沉淀作用：一些物理化学因素往往会导致蛋白质分子结构，尤其是空间结构破坏，因而失去其原来的性质，这种蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶剂中。重金属盐，生物碱试剂、过酸、过碱、震荡、超声波和有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀。 重金属盐类Cu２＋、Ag＋、Pb２＋和Hg２＋等均能与蛋白质分子中的巯基等基团结合，生成不溶物而沉淀。 生物碱试剂与蛋白质结合形成不溶物，使蛋白质沉淀。植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱 (或植物碱)。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂与蛋白质的碱性基团反应。 过酸、过碱、加热、震荡和超声波等均能使蛋白质的空间结构破坏，改变其原有性质。从而形成沉淀。试剂和器材 试剂 卵清蛋白液：将鸡(鸭)蛋清用蒸馏水稀释20～40倍、8层纱布过滤，冷藏备用。 饱和硫酸铵溶液 1%醋酸铅溶液 硫酸铵粉末 1%硫酸铜溶液 10%三氯乙酸溶液 0.5%磺基水杨酸溶液 1%醋酸溶液 5%鞣酸溶液 饱和苦味酸溶液 晶体氯化钠 95%乙醇 器材 试管及试管架 量筒 牛角勺 刻度吸管 滤纸 漏斗 操作步骤 蛋白质的盐析作用 取蛋白质溶液5mL，加入等量的饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，球蛋白即析出(如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵)。 将上述混合液过滤(或离心)、取滤液(或离心上清液)加硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。 酒精沉淀蛋白质 取蛋白质溶液1mL，加晶体NaCl少许(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再加入95%乙醇2mL混匀。观察有无沉淀析出。 有机酸沉淀蛋白质 取2支试管，各加入蛋白质溶液约05mL，然后分别滴加10%三氯乙酸和05%磺基水杨酸数滴，观察蛋白质沉淀。 生物碱试剂沉淀蛋白质 取2支试管各加入2mL蛋白质溶液及1%醋酸4～5滴。其中一管加5%鞣酸溶液数滴，另一管中加入饱和的苦味酸溶液数滴，观察沉淀的形成。 重金属盐沉淀蛋白质 取试管两支各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀生成。 思考题 1.为什么鸡蛋清可用作铅、汞中毒的解毒剂? 2.蛋白质分子中的哪些基团可以与 重金属离子作用，而使蛋白质沉淀? 有机酸、无机酸作用，而使蛋白质沉淀? 生物碱试剂作用，而使蛋白质沉淀?实验二 考马斯亮蓝G-250比色法测蛋白质含量 一目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。二原理考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，其结构如下图。它在游离状态下最