08-8分离纯化的前期步骤精品课件.pptVIP

第八章 生化物质的制备和分离纯化 生化物质的制备和分离纯化 分离纯化的一般步骤 选材 细胞破碎 抽提 分离纯化 结晶 纯度鉴定 保存 8.1 分离纯化的一般步骤 选材 细胞破碎 抽提 分离（沉淀法、离子交换法） 纯化 （分子筛、电泳） 结晶 纯度鉴定 保存 分离提纯某一特定蛋白质的一般程序可以分为 前处理 粗分级 细分级 第一步是前处理(pretreatment)。 分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。 第二步是粗分级(rough fractionation)。 当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。 一般这一步的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。 第三步是细分级(fine fractionation)，也就是样品的进一步提纯。 样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。 进一步提纯，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。 必要时还可选择电泳法。 8.2 材料的选择与处理 含量高 容易得到 干扰物质少 价格便宜 容易分离 安全性好 选材 含量高 容易得到 干扰物质少 价格便宜 容易分离 安全性好 提取工艺简单 有综合利用价值 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量， 以微生物为材料时有两种情况: （1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等； （2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。 植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。 对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。 另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 8.3 细胞破碎 （1）碾磨法/组织捣碎法 （2）超声波破碎法（10-15KHz） （3）渗透压法（高渗或低渗处理） （4）冻融法 （5）表面活性剂处理法（SDS、Tween、TritonX） （6）细胞自溶法（利用细胞自身的酶） （7）丙酮法（冷丙酮脱水抽提） （8）酶处理方法 （1）碾磨法/组织捣碎法 是最普通和常见的细胞破碎方法。 既可以使用普通的高速组织捣碎机、细胞匀浆器，也可使用专门的用于微生物细胞破碎的细菌磨等。 (2)超声波破碎法 使用专一的超声波破碎仪，利用仪器所产生的超声波（10~15kHz）机械震动后对组织细胞产生的空化作用（Cavitation）使细胞破碎。 对动物材料的效果比微生物材料和植物材料要好。 (3)渗透压法（高渗或低渗处理） 渗透压就是用来抗衡渗透倾向所需的一种力。 　先将细胞置于高渗溶液(如蔗糖溶液)中平衡一段时间后，突然将其转入到低渗缓冲液和水溶液中，则细胞壁会因渗透压的突然变化而破碎。 此法只适于处理细胞壁比较脆弱的细胞。 (4)冻融法： 将细胞在低温(-15℃)下冰冻后再在室温下融化，如此反复多次就能使细胞壁破裂。此法也只适用于胞壁易破的细胞。 (5)表面活性剂处理法： 在适当的温度、pH及低离子强度下，表面活性剂（如SDS、Tween、TritonX）能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。 此法对膜结合的酶的提取是相当有效的，但对其他蛋白质则易使之变性，甚至切断肽链。 （6）细胞自溶法 利用细胞自身的酶 (7)丙酮法（冷丙酮脱水抽提） 丙酮等脂溶性溶剂可溶解细胞膜上的脂质化合物，从而使细胞膜的结构破坏。 一般是将细胞制成丙酮干粉后，再加提取酶。 (8)酶处理方法 用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶(如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等)在一定条件下作用于细胞而使细胞壁破碎。 但这种方法因需外加酶制剂，因此可能会对后续目的酶的提取产生不利的影响。 8.4 抽提 物质的抽提常常和细胞破碎步骤协同进行 根据被提取物质的溶解特性，选择适当的溶剂 始终保持低温操作，防止生物活性物质变性 提取的原则是“少量多次” 尽量去除干扰物质 防止水解酶的作用 加入一定的保护试剂 其他影响因素：pH、溶剂极性与离子强度等 蛋白质（包括酶）的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材