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Western Blot 基本操作流程 对于小分子量蛋白(100 kD) 1、SDS不利于蛋白质和膜的结合，小分子量蛋白尤其明显。如果目的蛋白很小的话，可将SDS从转膜缓冲液中去除。 2、保持甲醇的浓度在20%。 转膜的注意事项 1、避免直接使用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。 2、夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。 3、保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大或过小都会影响转膜效率。 4、鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜。 Western Blot 基本操作流程 三、封闭 为什么要封闭？ 杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。 常用的封闭试剂有1-3%的BSA或者5%的脱脂奶粉，缓冲液一般选择PBST或者TBST。 一般封闭条件为：室温或者37℃1-2hr，特殊情况也可4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。 封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST或者PBST，其中的Tween有助于去除非特异性的结合，减少背景。 同时短时间多次的洗膜（如5-6次，每次3分钟）比长时间少次数的洗膜更有效。 Western Blot 基本操作流程 STEP3 抗体孵育和检测 Western Blot 基本操作流程 一、一抗、二抗的孵育 把膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜（一般大于18个小时）。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜5次，3min、5min、3×15min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时。 用TBST漂洗膜4次，3min、5min、2×10min。 Western Blot 基本操作流程 内参的使用 ――WB过程监测以及目的蛋白定量的标准！ Western Blot 基本操作流程 注意： 1、如果背景不是很高，很多抗体在含有低浓度BSA或脱脂奶粉（0.25-0.5%）的稀释液中会有很好的信号。 2、二抗选择：根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适的二抗。比如，如果一抗是小鼠IgG 来源的抗体，二抗需选择抗小鼠IgG 的；如果一抗是小鼠IgM来源的抗体，则二抗要选择抗小鼠IgM的。 二、底物孵育和检测 化学发光法(ECL): 灵敏度高，已经成为一种使用趋势，推荐使用。 显色法：操作简单、无需暗示等曝光设备。 Western Blot 基本操作流程 Western Blot 基本操作流程 三、关于杂交膜的反复利用 Western Blot 简介 Western Blot 原理 Western Blot 基本操作流程 常见问题分析 附录：试剂的配置 目录 常见问题分析 常见问题分析 常见问题分析 常见问题分析 常见问题分析 Western Blot 简介 Western Blot 原理 Western Blot 基本操作流程 常见问题分析 附录：试剂的配置 目录 附录-常用试剂的配制 SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 PVDF膜需要小心预处理：将