细粒棘球蚴重组hsp70基因的表达、纯化及免疫学鉴定.docVIP

细粒棘球蚴重组HSP70基因的表达、纯化及免疫学鉴定 【摘要】 目的 构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus，Eg)热休克蛋白70(Heat shock protein，HSP70)基因的重组质粒并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。方法 从重组质粒HSP70/pGEM-T中酶切HSP70目的片段，亚克隆入表达载体pET-28a，转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS进行融合表达，经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化，SDS和Western blot方法鉴定表达产物。结果 成功构建Eg.HSP70/ pET-28a/ E.coli BL21基因工程菌株，诱导表达重组蛋白和纯化分离得到14kDa Eg.HSP70均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别。结论 初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性。 【关键词】 细粒棘球蚴；热休克蛋白HSP70；表达；纯化；免疫鉴定 　　Abstract: Objective To const ruct HSP70 gene gene and express prokaryotically it , to purify and identify the immunogenicity of recombinant HSP70 protein. Methods Eg.HSP70 gene was attained from Eg.HSP70/pGEM-T recombinant plasmid and subcloned into high level expressed vector pET-28a. E.coli BL21(DE3)plys was sonst ructed. Western blot and ELISA were used to identify the immunogenicity of the recombinant protein. Results E.coli BL21(DE3)plys srecombinant plasmid was const ructed. Western blot analysis showed that recombinant protein and protoscolex , cystic fluid and cystic wall of 14kDa Eg.HSP70 could be recognized by this antibody.Conclusion pET-28a/HSP70 recombinant plasmid is constructed and expressed efficiently. The antigenicity and immunogenicity of Eg.HSP70 protein is identified. 　　Key words: Echinococcus granulosus；heat shock protein70；protein expression；purification；immunological identification 细粒棘球蚴病(Echinococcosis)是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg.)幼虫引起的一种人畜共患寄生虫病，呈世界性分布。我国是包虫病流行的严重地区。目前包虫病的治疗主要以手术及药物治疗为主，但存在复发率高等缺点。随着分子生物学技术的发展，近年来对包虫病的分子疫苗研究取得了可喜进展［1］。本研究通过构建Eg.HSP70/ pET-28a/E.coli BL21基因工程菌株，旨在为筛选包虫疫苗的候选抗原基因打下基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 质粒、菌株和试剂 　　质粒HSP70/pGEMT［2］、兔多克隆抗血清［3］由本室保存，E.coli BL21(DE3)plysS、pET-28a、His-bind树脂纯化试剂盒购自Novagen公司。质粒提取纯化试剂盒、蛋白分子质量标准、羊抗兔IgG-HRP、均为华美生物公司产品。限制性内切酶BamHⅠ、NotⅠ购自北京赛百盛基因技术有限公司。T4DNA Lingase及IPTG购自Promega公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 重组表达质粒Eg.HSP70/pET-28a的构建及鉴定用BamHⅠ、NotⅠ同时对已构建的Eg.HSP70/pGEMT重组质粒和表达载体pET-28a进行双酶切，将目的片段与pET-28a在T4连接酶的作用下，4℃连接过夜。连接产物转化入感受态细菌E.coli BL21(DE3)plys