植物参考生理生化测定.doc

2.1.8转基因植株在盐胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 将转基因植株与非转基因对照植株继代于含有0.5% NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为27±1℃，每天13 h、3000 lux光照。胁迫培养4 w后，取其叶片测定其SOD活性，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。 2.1.8.1主要试剂及配方 （1）0.1 mol/l pH 7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液 A液（0.1 mol/l Na2HPO4溶液）：称取Na2HPO4·12H2O 7.163 g，用少量蒸馏水溶解后定容至200 ml，4℃冰箱中保存备用； B液（0.1 mol/l NaH2PO4溶液）：称取NaH2PO4·2H2O 0.780 g，用少量蒸馏水溶解后定容至50 ml，4℃冰箱中保存备用； 取上述A液183 ml与B液17ml充分混匀后即为0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液，4℃冰箱中保存备用。 （2）0.026 mol/l甲硫氨酸（Met）磷酸钠缓冲液 称取甲硫氨酸（C5H11NO2S）0.388 g，用少量0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，再用相同磷酸钠缓冲液定容至100 ml，现用现配，4℃冰箱中保存可用1～2 d。 （3）7.5 × 10-4 mol/l NBT溶液 称取NBT（C40H30Cl2N10O6）0.153 g，用少量蒸馏水溶解后，定容至250 ml，现用现配，4℃ 冰箱中保存可用2～3 d。 （4）含1.0 μmol/l EDTA的20 μmol/l核黄素溶液 A液：称取EDTA 0.003 g，用少量蒸馏水溶解； B液：称取核黄素0.075 g，用少量蒸馏水溶解； C液：合并A液和B液，定容至100 ml，此溶液即为含0.1 mmol/l EDTA的2 mmol/l 核黄素溶液，避光保存（可用黑纸将装有该液的棕色瓶包好），4℃ 冰箱中可保存8～10 d，当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0 μmol/l EDTA的20 μmol/l核黄素溶液。 （5）含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液 取0.1 mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液50 ml，加入2 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮），充分溶解后移入100 ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀，4℃ 冰箱中保存备用。 2.1.8.2提取及测定方法 （1）称取1.0 g样品叶片于预冷的研钵中，加入4 ml预冷的提取介质（含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液），冰浴研磨匀浆，转入10 ml离心管，并用提取介质定容至5 ml； （2）4℃ 10000 rpm离心10 min，取上清即为酶液提取样品； （3）取透明度好的10 ml离心管，每个株系3次重复，按照下表加入试剂： 试剂 用量（ml） 0.05 mol/l磷酸缓冲液（2% PVP） 0.875 0.026 mol/l Met缓冲液 1.5 750 μmol/l NBT 0.3 1 μmol/l EDTA及20 μmol/l核黄素 0.3 酶提取液（对照管以磷酸缓冲液代替） 0.025 总体积 3.0 （4）设3个对照（CK1、CK2、CK3），将CK1包上铝箔避光，与其它样品管（包括CK2和CK3）同时置于4500 lux日光灯下反应25 min，反应温度28℃； （5）SOD活性测定与计算：至反应结束，立即用黑布遮蔽以终止反应。以遮光的对照管CK1作为空白调零，在560nm波长下测定各管的吸光度，CK2和CK3的平均值作为对照，按下例公式计算SOD活性（SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位）： SOD活性（U/g）=（OD0 -OD560）×VT／（OD0×0.5×FW×V1） OD 0——光照对照管的光吸收值； OD 560——样品管的光吸收值； VT——样液总体积（ml）； V1——测定时样品用量（ml）； FW——样品鲜重（g）。 2.1.9转基因植株在盐胁迫下的丙二醛(MDA)含量测定 将转基因植株与对照植株继代于含有0.5%NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为27±1℃，每天13 h、3000 lux光照。胁迫培养4 w后，取整株测定其丙二醛含量，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。 2.1.9.1主要试剂及配方 （1）5%三氯乙酸（TCA）：称取5 g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，再定容至100ml； （2）0.5%硫代巴比妥酸（TBA）：称取0.5 g硫代巴比妥酸，用5%TCA定容至100 ml。 2.1.9.2提取及测定方法 （1）称取1.0 g材料，加入10 ml 5%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂