2017整理4.免疫组化技术-理论篇.pptVIP

免疫组织化学（理论篇）(immunohistochemistry) 免疫组化的标记物 酶标记 胶体金标记 荧光标记 放射性标记 免疫组化的标记物 酶标记： 应用最广泛 常用标记物： -辣根过氧化物酶(HRP): 染色时同时加底物H2O2和供氢体（DAB）或AEC，生成棕色（DAB）或红色（AEC） HRP+DAB（H2）+H2O2=HRP+2H2O+氧化型DAB呈色 -碱性磷酸酶(ALP)：以萘酚As-Ms磷酸盐为底物，快蓝FB/快红FR为呈色剂，生成蓝色/红色沉淀。主要用于内源性过氧化物酶多得血细胞和淋巴细胞 免疫组化的标记物 胶体金标记： 以胶体金做标记物对组织或细胞内的抗原进行定位、定量研究的方法。胶体金是一种特殊的金属颗粒，呈淡红至深红色，可在光镜下观察。胶体金颗粒大小不同，电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合免疫电镜观察。 免疫组化的标记物 荧光标记: 以荧光素做标记物,与其相对应的抗原或抗体起反应后, 形成带有荧光素的免疫复合物上,在荧光显微镜下观察抗原抗体反应结合部位, 对组织中的抗原或抗体进行定位，定量分析。 常用荧光素： 异硫氰酸荧光素（Fluorescien isocynate FITC）：黄绿色荧光 德克萨斯（Texas red TR）：鲜红色 罗丹明（Rhodame TRITC）红色 花青5（Cyanine CY5):蓝色荧光 免疫组化标记物 放射性标记： 使用放射性同位素作为示踪物，应用放射性自显影术对组织中的抗原进行分析。 免疫组化的检测系统 石蜡切片标本的处理： 组织离体后尽快固定，切开固定效果好，固定液以10％福尔马林缓冲液为佳，固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果。 标本的取材厚度以2mm为宜，梯度酒精脱水尽量彻底充分，二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组织发硬发脆。浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分。 切片通常以3～4um的厚度为宜,太厚易掉片，细胞重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想。裱片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（48～50℃），玻片用APES或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性。80 ℃烘烤1～2h。 冰冻切片的处理： 冰冻切片的组织抗原保存好，缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细胞肿胀等现象。通常以5um的厚度为佳，冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存。 石蜡切片应用3％的新鲜H2O2进行封闭， 以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min。 热抗原修复的缓冲液 有多种不同的修复液，如 pH6.0 柠檬酸缓冲液（最常用）、尿素、Tris-HCl、商品化修复液等。 碱性 pH 修复液常对绝大多数抗体的效果更好。 推荐使用：EDTA 缓冲液 pH 8.0 或 Tris-EDTA 缓冲液 pH 9.0 是较好的常规修复液，可用于大多数热修复有效的抗体（有选择性, pH6.0缓冲液对抗体CD7可能获得结果最佳）。 PAP笔画圈时应在组织外围2mm左右，不宜太靠近组织。 滴加抗体时应从外周环绕，不直接滴加在组织中间，易浪费抗体。 缓冲液中加入适量的乳化剂，可使抗体均匀弥散，节省抗体，如Triton X-100等 。 过氧化物酶抗过氧化物酶法（ PAP） 碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP） 卵白素-生物素复合物法（ABC） 链酶卵白素-生物素法（LSAB） 抗生物素蛋白链菌素-生物素复合物（SABC） 酶标聚合物法（LDP）如EnVision法 增强聚合物一步法（EPOS） 催化信号放大法（ CSA） 标本的处理时的注意事项 标本的处理时的注意事项 标本的处理时的注意事项 标本的处理时的注意事项 内源性过氧化物酶的封闭 减少边缘效应的方法