溶菌酶检验标准.doc

术语和定义 溶菌酶酶活性单位：在25℃、pH值为6.2的条件下，于450nm处每分钟引起溶酶小球菌体（Micrococcus Lysodeiktidus）溶液吸光度下降0.001所需要的酶量为一个酶活性单位U。本定义适合“比浊法”。 溶菌酶效价：溶菌酶在一定浓度范围内，其对数计量与抑菌圈直径（面积）呈对数关系，通过检测其对微生物的抑制作用，比较标准品与样品产生抑菌圈的大小，计算出样品的效价，单位为u。本定义适合“管碟法”。 技术要求 外观和性状要求 粉酶为白色或微黄色的结晶或无定形粉末。 技术指标 粉酶水分含量：≤12%。 粉酶粒度：420μm孔径分析筛筛上物≤4%。 粉酶炽灼残渣：≤10.0%。 酶活（效价）指标 表1 产品成分分析保证值 项目 指标 粉状50型 溶菌酶酶活性（效价），≥U/g（u） 500000 卫生指标 符合GB 13078和NY/T 722的有关规定。 试验方法 本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682中规定的三级水，所用试液中的标准溶液，在没有注明其他要求时均要求按GB/T 601，GB/T 602制备。 外观的测定 取样品少许放入烧杯，下衬白纸进行目测。 粉酶水分的测定 按GB/T 6435 规定进行检测。 粉酶粒度的测定 按GB/T 5917 规定进行检测。 粉酶炽灼残渣的测定 按《中国兽药典》规定进行检测。 卫生指标的测定 按饲料卫生标准GB13078和NY/T 722规定的方法进行。 溶菌酶酶活性（效价）的测定 溶菌酶微生物测定法系在适宜条件下，通过检测溶菌酶对微生物的抑制作用，计算出溶菌酶活性（效价）的方法。依据试验设计原理不同，可分为比浊法和琼脂扩散法（即管碟法）。 试剂和溶液 溶酶小球菌（Micrococcus Lysodeiktidus） 将溶酶小球菌接种于固体培养基上，置37℃培养48小时，用无菌水将菌体洗下，用纱布滤过，滤液离心后，倾去上层清液，用水洗涤菌体数次，然后用少量水悬浮，冰冻干燥，得淡黄色粉末，供测定用，保存一年。 使用时，在营养琼脂斜面上活化，传代培养，工作用菌种不超过5代，斜面菌种从培养好到使用时间，最长不超过2个月。并将培养好的斜面菌种，放置4℃冰箱保存。制备的菌悬液可以使用一周，不用时放置4℃冰箱保存。 磷酸缓冲液 称取磷酸二氢钠（NaH2PO4.2H2O）11.7g, 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）7.86g，加900mL水溶解,调pH值至6.2，定容至1000mL。 10％氢氧化钠溶液 1％硫酸铜溶液 30%三氯醋酸 斜面培养基：营养琼脂 抗生素检定培养基II号 溶菌酶标准品 仪器 分析天平：精密度0.1mg； 牛津杯：牛津杯内径6.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm，高10.0±0.1mm，每套牛津杯的重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光滑平坦。管壁厚薄一致； 陶瓦盖：内径约103mm，外径108mm,平坦，吸水性强。应定期清洗、干燥或干热灭菌； 游标卡尺：精度0.02mm； 双碟：内径约90mm，外径16mm～17mm的硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡； 超净工作台：有效工作面局部洁净度100级。用于试验菌的接种传代或菌悬液制备； pH酸度计：精确到0.01； 分光光度计：配10mm比色皿，可在450nm下测定吸光值； 离心机：转速为4000r/min以上； 秒表：每小时误差不超过5s； 恒温培养箱：设置漂移温度为35℃～37℃； 高压灭菌锅 烘箱 其它玻璃器皿：刻度吸管: 1 mL，2mL，5mL，10mL，25mL无菌吸管等； 试验方法 5.6.3.1鉴别 固体样品：取本品10mg，溶于1mL水中，加30%三氯醋酸2滴，产生白色沉淀。 取试管一支，加5%溶菌酶水溶液2滴、10%氢氧化钠5滴及1%硫酸铜溶液1滴，混匀后，应显紫玫瑰色。 5.6.3.2方法一：比浊法 特定浓度的溶酶小球菌悬浮液在450nm条件下存在一定吸光度，溶酶菌作用于溶酶小球菌底物会引起吸光度降低，通过计算指定时间内吸光度降低的幅度可以计算出溶菌酶的活力。 试验步骤： 精确称取样品（液体样品需在离心机上以3500r/min离心10min后取上清液）不少于20mg，用pH6.2的0.1mol/L磷酸缓冲液稀释到酶活单位为100U/ mL ~200U/mL，备用。 将保存好的溶酶小球菌在营养琼脂斜面上活化，传代两次后的菌体37℃培养48小时，再用生理盐水从培养基上洗脱下来，并稀释到一定倍数，使其在25℃时，在450nm波长处测定的吸光度A0为0.65～0.75之间。 精密取底物悬浮液2.5mL，放入比色杯中，在450n