宏基因组学.doc

宏基因组学研究进展 姚刚 （厦门大学 生命科学学院 福建 厦门 361005 ） 摘要：宏基因组（Metagenomics）是指在特定环境中全部遗传基因的总和。宏基因组技术直接提取环境样品总DNA,避开了微生物分离培养的问题,极大扩展了微生物资源的利用空间,增加了获得新生物活性物质的机会。简要介绍了宏基因组的概念宏基因组;宏基因组文库构建; 宏基因组文库筛选中图分类号：Q 356．1 文献标识码：AMetagenomics）出现。所谓宏基因组学是指不经过微生物培养直接提取环境中的总DNA,从而对微生物的基因总和进行研究的一门新科学。据估计在自然界中，目前能够被培养的微生物大概占到全部微生物总数的0.1%-1%[1].宏基因组学通过从环境样品中提取全部微生物的遗传基因，从而使得一些原本难以研究的不可培养微生物的研究成为了可能，跨越了微生物研究的初始瓶颈。目前，宏基因组学应用的研究范围已经从原来最初的对土壤中的微生物的研究，扩展到了对海洋底部沉积物、空气悬浮物、动植物附生微生物的研究以及环境生物修复[2，3，4]。 本文就宏基因组学的研究策略，热点研究内容进行了探讨介绍，并对其发展前景进行了展望。 1 宏基因组学的研究策略 宏基因组学作为一种新兴的微生物研究方法，增加了获得新生物活性物质的机会。其研究策略的主要如下：样品中基因富集；提取特定环境中基因组DNA；构建宏基因组的文库；筛选目的的基因以及活性产物的表达。 1.1 样品中的基因富集 在环境中，目的基因只占总基因的一小部分，因此，要提高目的基因的获得，就要对环境中的基因记性预先富集。富集的手段主要集中在两个方面：基因组水平和细胞水平。细胞水平的富集主要是利用选择性的培养基对目的微生物进行富集培养。但是这种富集方法有一定的缺陷性。首先，这种富集方法只能富集生长快速的菌群，而目的基因存在的菌群可能由于不具备这个特性而被丢失。基因组水平富集常用的技术为稳定同位素探针技术(SIP), 原理是采用稳定同位素标记底物, 其中的“重”原子掺入到具有代谢活性的微生物核酸中,采用密度梯度离心的方法将“重”的DNA 与“轻”组分分离, 被标记的“重”核酸可以作为 PCR 的模板,用来构建宏基因组文库[5]。另外还有一些其他的手段来富集目的基因如：DNA微小矩阵法[6]、差异显示技术[7]等. 1.2 宏基因组获得 宏基因组DNA的获得市构建宏基因组文库的前提，为了后面文库的构建，在宏基因组DNA获得的过程中，应该尽可能的让DNA的浓度高，片段大一些。这就要求对处理后要的宏基因组DNA进行提纯。 处理的手段主要有两种，一种是样品不经过培养和分离，直接破碎释放胞内DNA，然后进行相应的纯化，这种称为原位提取法。这种方法简便省时，而且DNA完整性好，可以用来反应环境中的菌群多样性。但是这种方法在获取DNA的时候容易受到样品环境中一些未知因素的影响，导致纯化效果不佳。另一种方法是先通过离心等手段，将环境中的菌群分离出来，通过纯培养的方法获得大量细胞，然后裂解后提取DNA.这种方法获得DNA纯度高，外界污染较少，但是比较繁琐费时，而且DNA的收集率偏低，不利于对菌群多样性的分析。 1.3基因文库构建 在红基因文库构建的过程中，载体和宿主的选择和十分重要。 1.3.1 载体的选择 载体选择在宏基因组技术中占有十分重要的地位，宏基因组文库的克隆载体有多种，根据其载体不同可以将文库分为以下几种：质粒文库、细菌/酵母人工染色体文库，噬菌体载体文库。以质粒载体和大肠杆菌构建而成的文库操作比较简单，拷贝数高，适合于纯度低、剪切严重的DNA模板[8.9]，但插入片段小。晒序言工作量大，活性比率低。噬菌体载体文库是一种高通量文库，该技术能够富集稀有DNA序列，但是表达出的蛋白分子量很小。 1.3.2 宿主的选择 转化率高、载体在其中稳定是在选择宿主的一个重要因素，E.coli是最常见的宿主细胞，其操作简单，容易培养，但是不能表达真核基因组。最近已有报道利用链霉菌、假单胞菌等真菌作为受体来鉴定有关新抗生素生物合成的基因[10,11]因此, 宿主系统的进一步探索是更有效的开发宏基因组资源的关键技术之一。 1.4 宏基因文库的筛选 宏基因组的文库容量较大,所以要根据研究目标的不同进行筛选。其中包括以功能为基础的筛选、以序列为基础的筛选和底物诱导基因表达的筛选。 宏基因文库的筛选方法主要有以下3种： （一）基于观察特定的表型,如微生物对抗生素的抗性、对特定物质的分解等,进而分析产生这些表型的基因或基因簇该方法的优点是可迅速发现工业、农业和制药业中具有重要作用的基因产物;缺点是这种筛选依赖宿主对相关物质的表达,且需要特异或高灵敏度的检测仪器;由于载体的容量有限,常不能克隆某些基因的全序列;同时,宿主对异