生化实验复习资料.doc

实验二 蛋白质的颜色反应 实验目的：1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式2.了解蛋白质的颜色反应原理。 3.学习几种常用的鉴定蛋白质的方法。 （一）双缩脲反应 原理：尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 步骤： （1）取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。 现象：出现的粉红颜色。 （2）向另一试管加卵清蛋白溶液约10滴和10％氢氧化钠溶液约10滴，摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇。 现象：观察到出现紫玫瑰色。 （二）茚三酮反应 原理：除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原性茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。 步骤：取试管1支，加入蛋白质溶液1ml，然后各加入0.1％茚三酮水溶液2滴，混匀后于沸水浴中加热1-2分钟。 现象：颜色由有粉色变紫红色再变蓝。 （三）黄色反应 原理：在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸(如酪氨酸，色氨酸等)残基上的苯环经硝酸作用可生成黄色的硝基化合物，在碱性条件下生成物可转变为深橙色的的硝醌衍生物，反应为： 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以都会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸后才能够发生黄色反应。 步骤：于一试管内，置蛋白质溶液10滴，浓硝酸3-4滴，加热，冷却后于室温下逐滴加入10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化。 现象：加入NaOH，振荡后出现颜色变成橙色 (四)考马斯亮蓝反应 原理：考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色：当它与蛋白质通过疏水作用结合后变成蓝色。 它染色灵敏度高。反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。 在0.01-1.0 mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。 步骤：在两个做好标记的试管中，分别对应加入1ml蒸馏水和2滴考马斯亮蓝染液，0.1ml蛋白质溶液和0.9ml蒸馏水和2滴考马斯亮蓝染液。观察两支试管有何区别。 现象：对照组呈棕红色，而实验组呈蓝色。 实验三 蛋白质的等电点测定和沉淀反应 实验目的：1、了解蛋白质的两性解离性质。2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。 原理：蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 蛋白质的等电点: 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。 不同蛋白质各有特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。 本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 步骤：（一）酪蛋白等电点的测定 1 取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀; 2 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。 现象：理论上pH为4.7的时候得到的沉淀最多。但是实验结果不明显。 （二）蛋白质的沉淀 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 （1）可逆的沉淀反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。 （2）不可逆沉淀反应