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第8章基因工程 基因工程 1、基因工程？ 在宿主细胞中克隆特定的基因并使其表达，以获得基因表达的产物，也可定向改造细胞或生物个体。 2、基因克隆？ 又叫分子克隆。即将特定的DNA片段通过载体导入宿主细胞，在受体细胞中复制、扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝。 2、基因工程的意义 1) 获得大量的有应用价值的酶：纤维素酶 2）得到有药用价值的生物制品：尿激酶 3）改造工业用微生物 4）可对一些疾病进行基因治疗 3、基因工程的基本环节 1）目的基因的获得 2）目的基因克隆 3）导入宿主细胞 4）表达 原核基因工程各环节浅析 1、目的基因的获得 1）提取基因组DNA，经PCR扩增获得 2）提取总RNA，经RT-PCR获得 3）化学合成 4）从基因组文库或cDNA文库中调取 2、DNA重组 1）DNA分子重组技术 在体外把特定的DNA片段插入核酸载体中并形成磷酸二酯键连接，从而组合成一个新的DNA分子。 2）载体：基因的渡船 一个可结合特定DNA片段并把它转运进细胞中的物质。常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。 载体的特点 ①能在宿主细胞中复制繁殖，复制能力越高越好。 ②容易进入宿主细胞，效率越高越好。 ③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。 ④容易从宿主细胞中分离纯化出来　　 ⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。 　　 克隆载体　为了基因克隆而用于携带DNA片段进入宿主细胞的自动自我复制的遗传成分。常用的载体是细菌质粒与修饰过的噬菌体基因组。 常用的克隆载体： 1）质粒 （10kb) 2）λ噬菌体(9-23kb)：以多克隆位点与筛选标记代替费必需区。 3）粘性质粒(40-50kb)：带有cos区的载体 表达载体　携带基因或c DNA 进入恰当的宿主细胞,并引导编码蛋白合成的经修饰的质粒或病毒。一般带可被宿主细胞识别的有基因表达调控元件：启动子，核糖体结合位点，转录终止序列。 常用的重组方法 1）粘性末端连接 2）加上同聚体的尾部 3）加人工接头 4）平末端连接 3、把重组DNA导入宿主细胞 1)转化：将质粒或其他DNA导入宿主细胞，并使其获得新的表型。 采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。 例：冷CaCl处理制备感受态细胞 用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔转化法 2）感染：噬菌体感染细菌 3）转染：重组的噬菌体DNA也可象质粒DNA的方式进入宿主菌，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。 4、转基因后的鉴定 1）根据重组载体的标志作筛选 2）核酸杂交法 3）PCR法 4）DNA限制性内切酶图谱分析 5）核苷酸序列测定 6）基因的表达产物鉴定 免疫印迹（Western-blot） 克隆基因的表达 原核常用表达体系：大肠杆菌 E.coli ori+抗性基因+ E.coli启动子+SD序列+克隆位点+终止信号 表达产物 基因表达的鉴定 真核基因工程各环节浅析 1、目的基因的获得 2、DNA重组 表达载体：穿梭质粒 E.coli ori+抗性基因+真核启动子/增强子+克隆位点+终止信号+尾 DNA的扩增 重组质粒转化大肠杆菌，挑出成功的克隆，大量培养培养，获得重组的质粒。 导入真核宿主细胞 常用方法： 磷酸钙共沉淀 电穿孔 脂质体 显微注射法 克隆的筛选 导入成功克隆的筛选 1、抗性基因与药物筛选 G418与neor基因 2、绿色荧光蛋白 真核表达 常用的真核表达系统： 1、昆虫表达系统：例，果蝇S2细胞 2、杆状病毒表达系统：例，Sf9细胞系 3、酵母的表达系统 有些时候会采用哺乳动物细胞 基因表达的鉴定 mRNA的检测 蛋白的检测 文献的阅读与分析 * 质粒载体 目的基因与载体重组 非融合蛋白 融合蛋白 原核基因工程流程图 提取基因组DNA或RNA 目的基因的获得 与载体重组 导入宿主细胞 克隆的筛选与鉴定 表达产物的鉴定 *