第三章细胞工程基本技术技术总结.ppt

生物科学与技术学院 第三章 细胞工程基本技术 第一节、实验室组成 1、准备室：是进行一切与实验有关的准备工作，包括培养基配制、器皿洗涤、培养基和器皿灭菌等，要求宽敞明亮，通风条件好。 2、无菌操作室：进行无菌操作，要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌状态。 缓冲准备区（更换衣帽、拖鞋、洗手等） 接种区（培养材料的无菌操作） 培养室（对离体材料进行控制条件下的培养） 细胞接种 细胞培养 智能人工气候箱 光照培养箱箱 2.辅助实验室 细胞学实验室 对培养材料进行细胞学鉴定和研究 由制片室和显微观察室组成 要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染 生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查 大型的次生产物生产实验室，还应建立有效物质分离实验室 第二节、无菌技术 1、培养用品清洗 培养过程中，细胞对有害物质非常敏感。 有害物质包括微生物、细胞残留物、非营养成份的化学物质等。 （1）玻璃器皿清洗：浸泡?刷洗?浸酸?冲洗 （2）胶塞清洗 （3）塑料制品清洗 2、灭菌方法 （1）物理灭菌法 紫外消毒、湿热消毒（高压蒸汽）、过滤消毒 （2）化学消毒法 巴氏消毒液、70%乙醇、次氯酸钠等 （3）抗生素消毒法 氨苄青霉素、链霉素、卡那霉素等 3、污染检测与控制 （1）细菌：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌等，通常细菌感染后培养基颜色变黄、浑浊，细胞出现病变（变圆、漂浮）。 （2）真菌：黑曲霉、毛霉菌、白色念珠菌等，真菌污染后培养液出现白色、浅黄色小点或颗粒漂浮于培养液表面、细胞生长变慢、培养液不浑浊，有纵横交错的丝状、管状或树枝状菌丝。 （3）支原体：常见污染、主要是消耗营养，细胞生长缓慢，培养液不浑浊。 （4）病毒：细胞病变，培养基不浑浊。 （5）细胞交叉污染：多细胞培养时容易发生。 第三节、显微技术 1、光学显微镜 （1）普通光学显微镜 （2）相差显微镜：利用光的衍射和干涉，把投过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰的明暗对比。 （3）倒置显微镜：物镜和照明系统颠倒，可观察培养的活细胞。 （4）荧光显微镜：单激光激发，观察荧光。 （5）激光共聚焦显微镜：激光扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，激光和荧光共用一个物镜，共聚一个焦点。 （6）暗视野显微镜：遮光片阻止照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入。 （7）偏光显微镜：检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤丝、染色体等。 2、电子显微镜 （1）透射电子显微镜（TEM）：电子束为光源，可进行超微结构观察。 （2）扫描电子显微镜（SEM）：电子束扫描物质表面，产生次级电子，通过收集次级电子信号，产生图像。 （3）扫描隧道电子显微镜（STM）：原子级的针尖加电压，利用针尖与样品之间产生隧道效应时释放的电子形成隧道电流，从而成像。可观察三态（固态、液态和气态）物质。 TEM SEM 第四节、细胞观察与分析 1、细胞计数与活力分析 台盼蓝染色：常用于检测细胞膜的完整性。还常用于检测细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。 MTT（甲基噻唑基四唑）：MTT可与活细胞中琥珀酸脱氢酶反应生成不溶于水的蓝紫色产物甲臜，甲臜沉淀在细胞内和细胞周围。 2、细胞固定与染色 （1）细胞固定：细胞固定后可制成标本进行长期观察。固定后的细胞即可显示细胞形态，也可以揭示细胞结构。 常用的细胞固定剂为： 甲醇/醋酸 FAA固定液（乙醇、冰醋酸、甲醛） Carnoy固定液（乙醇、氯仿、冰醋酸） （2）细胞染色： H.E染色（苏木精-伊红）：分别对细胞核和细胞质进行染色。 Giemsa染色：可将细胞核染成紫红色，细胞质染色粉红色。 Feulgen染色：能专一性对DNA进行染色。 考马斯蓝染色：染色细胞骨架、细胞内微丝。 免疫荧光法和免疫过氧化物酶法：抗原和抗体反应。 第五节、细胞分离技术 1、细胞初步分离 差速离心法：根据不同细胞的大小、沉降速度进行分离。 2、单细胞分离 （1）有限稀释法 （2）显微操作法 （3）流式细胞分选技术 流式细胞仪：是让细胞粒子或小颗粒在细小液流的带动下逐个通过检测点，在通过检测点时受到与液流方向垂直的UV光或镭射光的照射，通过检测光信号的改变来测量细胞或小颗粒的性质。 流式细胞仪能对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选。 流式细胞仪及其数据分析 第六节、细胞保存与复苏 1、细胞保存 传代培养法：悬浮细胞每隔1-2周传代一次，适用于植物细胞。 低温冷冻保存法：终止细胞的代谢和生长。 玻璃化法：防止冰晶、晶体的形成。 （1）冷冻保存剂：也叫冷冻保护剂 渗透性冷冻保护剂：甘油、DMSO、乙二