§4基因诱变与蛋白质工程.pptVIP

蛋白质工程 * * 理论上，人们可以利用基因重组技术，分离克隆出编码自然界中所有蛋白的基因，再让其再特定的宿主细胞中表达，进一步纯化出可商品化的产品。 实际上，许多天然蛋白的物理、化学性质并不适合工业生产。 所以人们利用蛋白质工程技术，对天然蛋白进行改造，进而设计、创造出新的、具有优良品质的蛋白质。 § 1 蛋白质工程简介 概念：蛋白质工程（protein engineering） 蛋白质化学 物理 通过对 蛋白质晶体学 的研究，获取蛋白质的 化学 蛋白质动力学 生物学 特性， 对编码基因进行有目的地改造 利用 表达 基因工程等手段，将其 分离纯化 最终投入使 制药 用 工业用途。 目前，蛋白质工程主要集中在对现有蛋白的改造方面。 基本步骤： 分离纯化目的蛋白 氨基酸测序、X-ray晶体衍射、核磁共振 了解该蛋白结构、功能的数据 根据其氨基酸序列，设计探针 从cDNA文库中钓出该蛋白的编码基因 对基因序列进行改造 插入合适的表达载体，导入宿主细胞，表达 分离表达产物，检测蛋白活性 对于一些了解不清的蛋白质，若要改进，可遵循一些经验规律： 1、疏水性氨基酸一般为活性中心区域的结构支架；Pro是结束?-helix的标志；Cys可能形成二硫键。 2、对于保守氨基酸要保护 3、保留潜在的糖基化位点（Ser、Thr、Asn），尤其对分泌蛋白、穿膜蛋白 4、对于有内含子的序列，可直接删去一个外显子或2个内含子与一个外显子的组合。 5、构建融合蛋白时，结合部位的构像要一致（?-helix对 ?-helix） 6、随机插入6bp接头，产生2个氨基酸，可以鉴定功能性结构域 7、不在天然存在的RE识别位点进行缺失突变，以防破坏ORF。 § 2 基因诱变 基本概念： 寡核苷酸介导的诱变（oligonucleotide-directed mutagenesis），又称定点诱变（site-specific mutagenesis），是指在DNA水平上改变氨基酸的编码序列。 诱变的前提条件： 了解要改变的基因编码区的精确的核苷酸序列 了解要引入的氨基酸变化 最好能了解蛋白质的三级结构 诱变的结果： 改变一个特定的核苷酸，进而改变一个氨基酸 对一段最可能引起蛋白质功能变化的基因进行随机突变，产生一系列突变蛋白 § 2·1 用M13 DNA 进行的寡核苷酸介导诱变 假设要将Ile改造成Leu，即将ATT 改造成CTT + ATT - TAA ds M13 载体 RE RE T4 DNA 连接酶 重组子 导入大肠杆菌，产生噬菌斑 分离出＋ssDNA 大量引物（ GAA ） 低温、高盐 发生错配(mismatch)