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ELISA 基本原理 ELISA 實驗步驟 Immunoassay 酵素免疫分析法( Enzyme Immunoassay ; EIA ) 螢光免疫分析法( Fluorescence Immunoassay ; FIA ) 冷光免疫分析法( Luminescence Immunoassay ; LIA ) ELISA Reader 判讀原理 原理 利用每一種物質皆有其獨特吸收波峰 如 : Protein 280 nm DNA ,RNA 260 nm pNPP 405 nm TMB 450 nm H2O 977 nm 原理 應用 1. DNA RNA 定量 260 / 280 Ratio DNA RNA / Phenol Ratio Lowry Protein Quant ( 660 nm ) Bradford Protein Quant ( 595 nm ) BCA Protein Quant ( 562 nm ) Spectrophotometer分光光度計 優點 : 連續性波長 ( 190 ~ 1100 nm ) 準確度高 , 可達 0.0001 Abs 1 cm 光徑cuvette , 可直接換算濃度 ELISA 實驗步驟(競爭型) * * ELISA ( Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay ):酵素免疫分析法 ELISA用的檢測盤 polystylene 抗原(sample) 鏈結酵素之抗體 呈色劑 ELISA 實驗原理 Coated 抗體 (Direct)Antigen detection polystylene Coated抗原 鏈結酵素之抗體 呈色劑 ELISA 實驗原理 (Indirect)Antibody detection 抗體(sample) Virus A Host:human IgG Host:Mouse IgG Label:HRP Human anti-virus A Mouse anti-human IgG , HRP Labeled Antibody? Name? 先將抗原coating在檢測盤的表面上4℃overnight，再進行blocking buffer處理 加入100ul sample, incubat 1hr 用wash buffer清洗3次(每次200-300ul) 加入100ul鍵結酵素之抗體, incubate 1hr 用wash buffer清洗 3次(每次200-300ul) 加入100ul呈色劑 ( substrate ) 10-15min後，加入50ul終止液(stop solution) ELISA reader進行OD(optical density)判讀 酵素與呈色劑的種類 Enzyme HRP(Horseradish Peroxidase) Substrate ABTS(405nm) TMB(450nm) AP(Alkaline Phosphatase) pNPP(490nm) ELISA 呈色劑 冷光劑 螢光劑 FIA LIA EIA 吸光值 light 激發光 放射光 ( I0) BEER`S LAW A = -logI/I0 = -logT =log1/T A:吸光值 T:穿透率 filter ( I ) Light Detector BEER`S LAW 啤酒定律 A = -logI/I0 = -logT = log1/T A = abc A = 吸光值 a = 常數 b = 光徑 ( 1 cm ) c = 濃度 ( g / L ) 利用分光光度計在260 nm直接定量 若OD(吸光值) = 0.8 , 已知 a(常數) = 0.02 mg/ml b(光徑) = 1 cm 公式 A=abc 因此 0.8 = 0.02 x 1 x c C = 0.8 x 50ug/ml = 40 ug/ml