基因工程总结.docVIP

主要内容: 第一章 基因操作的基本技术 核酸制备；质粒及质粒载体；细菌的转化；凝胶电泳；核酸探针；限制性内切酶、酶切图谱及分子克隆用酶 第二章 PCR技术 第三章 核酸分析与合成 第四章 噬菌体载体及粘粒 第五章 目的基因的准备和重组及重组子的鉴定 第六章 基因在原核及真核体系中的表达 真核基因在大肠杆菌中的表达；哺乳动物基因工程；研究DNA与蛋白质相互作用的方法 第七章 植物基因工程 第八章 基因工程研究进展 人类基因组计划；基因诊断、基因治疗和转基因；反义技术 序言： 1.什么是基因工程？基因工程是如何诞生的？ 答：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这类分子的宿主细胞中，并能持续稳定的繁殖。 2.基因工程的两个基本特征？ 答：（1）跨越天然的物种屏障（2）确定的DNA扩增 3.基因工程的步骤和内容？ 答：酶切分离目的基因→重组DNA分子→转移至受体细胞增殖→获得筛选目的重组子(→提取目的基因供进一步研究→重组目的基因功能表达) 4.基因工程可以应用于哪些方面? 答：(1)带来体外蛋白质化学的革命:甲型干扰素，红细胞生成素。 （2）对检测技术的贡献：提供大量高纯靶，提高准确性；病原体检出（HCV HBV HIV）；遗传病诊断。 （3）直接的遗传性疾病治疗和生物体改造：转基因动植物。 （4）促进对生命现象本质机理的研究：胰岛素基因与糖尿病、癌基因与抗癌基因。 5.什么是“安全”的宿主—载体体系？ 答：失去自我迁移能力，可以是营养缺陷性，在自然环境下无法生存。 第一章 基因操作基本技术 1、提取细胞总RNA的原则是什么？如何实施？为什么? 答: 原则：抑制RNA酶活性 实施：（1）高温：180℃，2小时，灭活RNase （2）二乙基焦炭酸乙酯（DEPC）,油状有毒, 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 （3）使用对RNase有强烈乙酯作用的细胞裂解剂，如盐酸胍、异硫氰胍（裂解细胞、抑制酶活性、解聚核糖体） （4）带手套、口罩：阻断RNA酶来源，加少污染机会。 （5）季节因素（温度）：RNase降解RNA温度高活性高，需要低温进行。 2.如何进行总RNA制品质量控制？ 答： 1）RNA的浓度和纯度测定 A260nm 1 OD=40 (g/ml RNA 要求 A260nm/A280nm=2.0 (1.7-2.0或2.0) A260nm/A230nm 2.0 2）RNA的完整性 变性琼脂糖凝胶电泳检查 28S：18S(2：1 3）总RNA制品的保存 溶液法（TE或0.5%SDS 方便 但不稳定) 悬液法（溶液加3V乙醇 可靠 但不方便） 3.染色体DNA制备的原则是什么？各有哪些主要试剂？作用？ 答：原则：祛除蛋白及细胞碎片，祛除RNA，保持DNA分子完整。 主要试剂及作用：SDS（破坏细胞膜结构、变性蛋白质、解聚） EDTA（抑制酶活性）Proteinase K（蛋白酶消化蛋白质） 4.如何进行DNA样品的鉴定？ 答： A260nm 1 OD=50 (g/ml DNA 要求 A260nm/A280nm 1.7 A260nm/A230nm 2.0 5. 有哪些方法可以进行DNA片段的制备？是如何进行的？ 答：（1）低熔点琼脂糖（羟乙基 60(C-65 (C熔化，结果较纯） （2）透析袋法：需要把样品浓缩，把核酸沉淀，而去掉缓冲液。 （3）苯酚抽提法 （4）反复冻融法：多次冻融使凝胶收到破坏，释放其中DNA，但回收率低 （5）电洗脱法 （6）硝酸纤维素膜离心法（7）试剂盒 6.什么是质粒？质粒有几类？ 答：质粒是一类亚细胞有机体，存在于细胞质中独立于染色体的遗传成分，由环状双链DNA组成的复制子。 分为： ①F质粒（致育质粒，可以通过接合，在供体和受体间传递遗传物质） ②R质粒（抗性质粒，带有抗性基因，可使宿主菌对某些抗菌素产生抗性） ③Col质粒：带有编码大肠杆菌素的基因。 ④降解质粒：可使宿主代谢特殊分子 ⑤侵入性质粒：使宿主菌具有致病能力 7.什么是质粒的转移？什么是质粒的迁移？迁移原理？ 答：质粒的转移：从一个细胞自我的转移到原来不存在这种质粒的另一个细胞去。 质粒的迁移：由共存的接合型质粒引发非接合型质粒的转移过程。 原理：当相容性的接合质粒和非接合质粒在同一细胞中，非接合质粒中mob编码的核酸酶作用其特异位点bom，使bom位点发生单链断裂而出现缺口，构象转变为缺口环状构象。当有接合性质粒中F因子能够导致性须的合成，提供转移装置，则可以转移。如果没有，缺口可能还原维持两种构象的动态平衡。 8.掌握质粒拷贝数的定义？质粒