芽孢杆菌胞外碱性白蛋酶的优化生产.docVIP

芽孢杆菌胞外碱性蛋白酶的优化生产 楚卫华 摘要 从牛奶加工厂、屠宰场附的水体和土壤中采集菌样，并分离出35株能够分泌碱性蛋白酶的菌株。枯草芽孢杆菌APP1菌株是碱性蛋白酶的高产菌株。将培养条件进行优化即可获得最高产量的蛋白酶。在50℃、pH9.0的条件下培养48小时，即可使培养物保持2,560U/ml的最高产酶活力。优化条件如下（/g）：豆粕15；小麦粉3；K2HPO44；Na2HPO41；MgSO4·7H2O0.1；Na2CO3 6。在SDS和氧化剂存在时碱性蛋白酶能够显示出极强的稳定性。将APP1菌株产生的碱性蛋白酶分别用5%的SDS和5%的H2O2处理72h，仍能保持73%以上的活力。 关键词：芽孢杆菌 产酶条件 胞外碱性蛋白酶 综述 蛋白酶是最重要的工业用酶之一，约占世界上酶生产总量的60%。在各种蛋白酶中，微生物蛋白酶在生物技术的加工过程中具有重要作用。其中，碱性蛋白酶是一种重要的工业用酶，它们被广泛应用于洗涤剂、食品、药品以及皮革的生产制造，蛋白质的水解、电影工业以及工业废水的处理等领域。 近年来，大量研究显示，从不同生物体如细菌、霉菌、酵母菌以及哺乳动物组织中获得的碱性蛋白酶具有不用的特性。虽然蛋白酶在自然界中的分布广泛，但微生物却是获得蛋白酶的首选。因为微生物的繁殖速度极快，占用的培养空间小，并且微生物为满足自身需要，在培养条件改变时易于获得转基因的新品种。在近期的研究中，我们报告的分离到的这个菌种（APP1），是一个生产胞外碱性蛋白酶的潜力菌株。 材料和方法 样本采集、分离和筛选 从牛奶加工厂、屠宰场的排水沟中采集土样。用生理盐水稀释后，将1g土样置于蒸馏水的强力涡流中，静置后取0.1mL稀释液直接浇注到镀有酪蛋白的碱性固体琼脂培养基上。37℃条件下培养48h后，挑取单个菌落在碱性酪蛋白琼脂平板上划线分离，重复两次。挑取单菌落在脱脂牛奶的琼脂平板上划线培养。脱脂牛奶平板成分：蛋白胨(0.1%，w/v）,NaCl(0.5 %，w/v),琼脂（2.0%，w/v），脱脂牛奶（10%，v/v）。 根据培养后单菌落周围透明圈的大小，确定其产碱性蛋白酶能力的强弱，筛选出蛋白酶的高产菌株，进一步研究。 菌种鉴定 菌种鉴定是基于微生物的形态学特征以及生理生化特征，然后将测得的一系列数据与《伯杰氏系统细菌学手册》中记录的模式种对比，从而鉴定出菌种类别的方法[2]。 蛋白酶的测定 在0.1 mol/L的甘氨酸氢氧化钠缓冲液（pH 11.0）中加入0.5％酪蛋白，进行碱性蛋白酶活性的测定[14]。一个酶活力单位是指在标准条件60℃下，每分钟催化1.0μmol底物转化为产物的酶量作为一个酶活力单位。 酶的生产及优化 从平板上选取透明圈大小合适的芽孢杆菌单菌落来研究蛋白酶活力。将菌落接种到TSB培养基平板上，置于4℃条件下培养。基本培养基配方（/g）：K2HPO44；Na2HPO41； MgSO4·7H2O0.1；Na2CO3 6；PH 7.5。将碳酸钠溶液分别灭菌，然后添加到培养基中，取500ml烧瓶中培养24h的培养物1mL接种到培养基上（100ml）。在37℃下以250转/分的速度摇瓶培养48h。通过离心分离（8000g，4℃，20min）收集上清液，为酶活力的测定做准备。 为了研究微生物的生长动力变化，吸取10%的菌悬液接种到100ml的灭菌培养基上，并于37℃下摇瓶培养24h（100rpm）。在600nm处对微生物的生长进行检测，然后收集样品并离心分离（6000rp，15min），收集上清液用于酶的测定。通过改变和控制培养基的条件，对烈性菌株进行详细的研究。 优化培养条件，可以使蛋白酶的产量达到最高值。例如控制培养时间（12h，24h，48h，72h），培养基的pH（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0），培养温度（37℃，50℃，65℃，70℃），碳源（小麦粉，葡萄糖，乳糖，麦芽糖），氮源（蛋白胨，豆粕，酪蛋白，硫酸铵）（表一），并添加表面活性剂和氧化剂。记录这些因素对蛋白酶产量的影响。 表一 不同的碳源氮源对APP1菌株产蛋白酶能力的影响 氮源 浓度（%） 蛋白酶活（U/ml） 碳源 浓度（%） 蛋白酶活（U/ml） 豆粕 0.5 1,023 小麦粉 2.0 678.4 1.5 2,560 3.0 1,110.5 2.0 1,364