工业微生物实验指导书(林化).doc

工业微生物实验指导书 （林产化工专业） 材料科学与工程学院 实验一 培养基的制备与灭菌 一、实验原理 马铃薯中含有淀粉、蛋白质、脂类及多种维生素经煮沸后可把这些营养成分从中溶出以供酵母和霉菌生长需要，加入葡萄糖或蔗糖以补充微生物所需的碳源。此培养基为半合成培养基。 二、实验目的： 1、掌握培养基的制备方法，2、学会高压蒸汽灭菌技术。 三、实验材料和仪器： 1、马铃薯、葡萄糖（或蔗糖）、琼脂。 2、烧杯、漏斗、试管、三角瓶、量筒、玻璃棒、纱布、棉花、细绳、牛皮纸、试管架、培养皿。 3、手提式高压蒸汽灭菌锅、天平、电炉。 四、实验方法与步骤： （一）玻璃器皿的清洗 配制培养基需要一些玻璃器皿，并且在使用前要对器皿进行清洗、包装和灭菌。新置的玻璃器皿应将其浸在2%的盐酸溶液中数小时；或用热水浸泡，再用去污粉或肥皂粉刷洗，最后经过热水洗涮、自来水冲洗、干燥灭菌备用。用过的玻璃器皿因含有大量的微生物应需先经高压蒸汽灭菌或沸水煮沸30min后，倒掉污物方可洗刷。吸过菌液的吸管，应将其放入盛有5%石炭酸溶液的高玻璃筒内消毒；未吸过菌液的，用水浸泡，防止干燥；吸过油的应在10%的NaOH溶液中浸泡30min，去油后清洗，如去不掉可置于洗液中清洗。吸管上端的棉花用钢针钩出，洗净的吸管顶端向下，下面垫一块干净的厚布或几层纱布，使水分迅速吸干。 （二）器皿的包扎 试管和三角瓶灭菌前，试管口和瓶口均须塞好棉塞，再在其外面包一层牛皮纸，用棉绳包扎，置于烘箱，灭菌备用。棉塞制作（如下图）（1）要求：棉塞紧贴玻璃管壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。制作好的棉塞拔出时会听到“叭”的一声响。棉塞长度不小于管口直径的二倍，约2/3棉塞长度进入管口。（2）作用：棉塞起过滤作用，避免空气中的微生物进入培养基内。 图1-1 棉塞的制作方法 洗净的培养皿按10~12套一包用报纸，或每10套一起放入特制的铁皮平皿圆筒内，加盖置于烘箱灭菌备用。 吸管在包扎前在其前部塞入少许普通棉花，以免使用时将菌液吸出污染或吹入空气污染。塞入的棉花和吸管的管口应保持5mm左右的距离。全长不得超过10mm。然后把吸管的尖端放在宽5~8cm纸条的一端，呈45°角折叠纸条，包住尖端，一手捏住管身，一手将吸管压紧再桌面上，向前滚动，以螺旋式包扎，最后打结，灭菌备用。 （三）培养基的制备 培养基制备的简单过程：配料→溶解→校正pH值→加凝固剂→融化→过滤→分装→加棉塞、包扎→灭菌→无菌检查 1、溶解配料 先在烧杯中放入所需水量的一半，称取培养基配方中的各种原料，依次加入水中溶解，最后补足水分。加入顺序缓冲化合物、主要元素、微量元素最后加维生素等。 2、调pH值 在室温下，用精密pH试纸或酸度计测溶液的pH值，用酸（6mol/l HCl）或碱(10%NaOH)调整。加入碱或酸时要搅拌，防止营养成分破坏。 3、加凝固剂 将凝固剂加入煮沸的液体中不断搅拌至融化，最后补足水分。 4、过滤 在两层纱布中夹入脱脂棉，趁热过滤。 5、分装 装入试管中的固体培养基不宜超过试管高度的1/5，装入三角瓶的小于总体积的一半。分装时应避免污染管口培养基的分装见下图 图1-2 培养基分装示意图 6、包扎 将分装好的试管和三角瓶塞好棉塞，若需好氧培养可以用6~8层纱布代替棉塞，其上用牛皮纸包好。 7、灭菌 将分装灭菌后的琼脂培养基试管置于水平放置的试管上，凝固后即成斜面，斜面长度不得超过试管长度的一半。 8、无菌检查 灭菌后的培养基在培养箱中培养24~48小时作无菌检查。 （四）本次实验步骤： 1、真菌培养基的制备 （1）选无芽、无腐烂的马铃薯、洗净、削皮、称40g切碎加水200ml,放入1000ml烧杯中煮沸0.5hr、冷却用纱布过滤去渣。 （2）在清液中加入4g葡萄糖溶解补水至200ml，此时到入一试管10ml。余下溶液加3.8g琼脂加热熔化。 （3）试管分装：取玻璃漏斗装在漏斗架上，漏斗下连一橡胶管，与玻璃管嘴相接，橡皮管上夹一弹簧夹，培养基倒入漏斗，通过弹簧夹控制培养基的流量。每人两支试管。 （4）余下的培养基分装在250ml的三角瓶中。 （5）高压蒸汽灭菌：把溶解完的培养基用棉塞塞上并用牛皮纸把棉花包住，在121℃，0.1Mpa下灭菌20min即可，灭菌时要注意放净阀气。取出灭菌物品时一定要等到压力降到零时打开灭菌锅盖。 （6）斜面摆放：将分装灭菌后的琼脂培养基试管置于水平放置的试管上，凝固后即成斜面。 （7）培养皿的洗涤与灭菌：培养皿每人两套清洗干净，控干水后用报纸包扎好置于160℃的烘箱内灭菌1.5-2小时，备用。 （8）培养皿培养基的倾倒：先用酒精棉球擦拭桌面及双手,在靠近酒精灯火焰的上方把冷却到