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全内反射荧光成像基本原理 Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)全内反射荧光显微镜(TIRFM) 目前用于单分子研究的检测技术主要有两大类：扫描探针显微技术（SPM）和光学技术。其中： 原子力显微技术（AFM）扫描隧道显微技术（ STM）SPM扫描离子电导显微技术（ SICM）共聚焦荧光显微技术（LSCM）光学显微镜成像扫描近场光学显微技术（SNOM）光学技术光学操纵全内反射荧光显微技术（TIRFM）发展历程 上世纪80 年代，Axelrod 等生物物理学家对 TIRFM 技术及基本原理进行描述，并探索了其在生物方面的应用。阿克塞尔罗德（Axelrod,Julius) 美国生物化学家及药理学家。 1970年他与卡茨冯奥伊勒共享了诺贝尔生理学和医学奖。于美国卫生研究院度过其大部职业生涯。他研究药物及激素的作用、神经冲动传播的化学方面，并特别研究松果体的功能。?Axelrod,Julius光反射和折射示意图全内反射示意图光的反射和折射RefractedSnell定律：?n2n1n2n1TIR?? 当入射角不断增大，透射角为增大 90°时，入射角达到临界角 θc。依据 Snell 定律得出：90on2n1?TIR 当入射角继续增大时，光不再透射进水溶液，即发生了全内反射。隐失波隐失波90on2n1?TIR 实际上，由于光的波动效应，有一部分光的能量会透过临界面渗透到水溶液中，平行于界面向水溶液中传播，这一部分透过的能量场则称之为“隐失波” 或“隐失场”。 隐失波的频率与入射光线的频率相同，其强度随临界面的垂直距离呈指数衰减： 其中：Z是离开分界面的距离，I(z)表示距离界面Z处的强度；I(0)表示临界面处的强度。 由于隐失波仅在界面上极薄的一层范围内传播，所以利用隐失波照明样品，可以仅激发厚度大约 100nm 内的荧光团，而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提高了显微成像的对比度和信噪比。 d12是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减 l/e 处的距离。隐失波强度成指数衰减曲线 隐失波的渗透深度d12是入射角及相对折射率的函数。 d12是渗透深度,它等于从分界面处到光强衰减到分界面处数值l/ e的处的距离。对于可见光波长而言，浸透深度约为100 nm。 隐失波存在的实验证明 两块光密媒质做的棱镜中间夹一薄层空气层(光疏媒质)。 如果不断减少空气层的厚度,由于空气层中有透射波,这透射波进人第二块棱镜。光学隧道效应 光强度并不发生全反射,而是有隐失波存于介质2中。当光疏介质薄膜的厚度小于隐失波的渗透深度时,这个波不仅穿过了光疏介质,而且会促进邻近高折射率介质3中的电子作受迫振动,由此产生了新的次波,隐失波的形态发生了显著改变,全反射被破坏,能量发生了流动,导致了光学隧道效应的产生。 全内反射荧光显微技术，是利用光发生全内反射时产生的隐失波照明样本，仅激发样本表面薄层范围内的荧光基团。 与传统的荧光显微镜相比，使显微成像在Z轴上的空间分辨率得到了显著改善，大大提高了图像的信噪比和对比度。全内反射荧光显微成像系统分子荧光的产生 当一束特定波长的光照射到物质时，物质分子与光量子发生“碰撞”。如果这次碰撞时有效的：S2放出热量H*S1放热H吸收hv荧光hv放热H**S0分子荧光的产生激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。荧光：10-7-10-9s磷光：10-4-100s电子跃迁的单重态（单线态）与三重态（三线态） 在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（n, π）处于不同的自旋状态，通常用多重态M来描述： M＝2S＋1＝1 电子自旋的大小用自旋量子数S表示，S可为+1/2或－1/2，这里的正负号取决于自旋的方向。基态中每个能级通常被两个自旋相反的即自旋配对的电子占据，M=1，成为单重态。 当成对电子中的一个被激发到S1、S2等电子能级激发态时，其自旋不变，即仍和处于基态的另一电子成对。这些能态都被称为单线态或单重态(singlet state)。 但如果处于第一电子激发态最低振动能级的电子通过无辐射跃迁（系间跨越，intersystem crossing)改变自旋方向，则因消耗部分能量而降至另一种激发态：S＝1/2＋1/2＝1，多重度 M＝2S＋1＝2?1＋1＝3，这种电子激发态称为三重态(triplet state)。 Π*Π*Π*能量ΠΠΠS1单重激发态S0单重基态T1三重激发态分子荧光的产生（雅布隆斯基分子能级图）分子荧光的产生 荧光发射：电子由第一激单重态的最低振动能级到基态，多为S1-S0。由于基态中也有振动弛豫跃迁，这使得发射荧光的能量比分子吸收的能量要小，所以，荧光的特征波长比入射波长要长。 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快：10-9—10